心肌细胞制备方法技术

本发明专利技术提供了一种心肌细胞的制备方法，多能干细胞在单层二元胶体晶体的培养基底中分化成心肌细胞，其中，所述单层二元胶体由二氧化硅胶体颗粒和PMMA胶体颗粒制备而成，并且所述培养基底表面涂覆有生物胶，本发明专利技术提供的心肌细胞的制备方法可以提高心肌细胞成熟度，使心肌细胞具有较好的电生理特性。

Preparation of myocardial cells

The present invention provides a preparation method of cardiac myocytes, in which multipotent stem cells are differentiated into cardiac myocytes in a monolayer binary colloidal crystal culture substrate, in which the monolayer binary colloidal particles are prepared from silica colloidal particles and PMMA colloidal particles, and the culture substrate surface is coated with bioglue. The preparation method of the myocardial cells provided by the present invention can improve the myocardial fineness. Cell maturity makes myocardial cells have better electrophysiological characteristics.

【技术实现步骤摘要】
心肌细胞制备方法
本专利技术涉及多能干细胞分化
，尤其涉及一种有多能干细胞制备心肌细胞的方法。
技术介绍
随着诱导多能干细胞技术的发展，人源诱导多能干细胞分化的心肌细胞(hiPSC-CMs)在药物筛选、疾病模型的构建及细胞治疗方面均表现出巨大的潜力，但是现阶段由多能干细胞分化心肌细胞方法的多样化，心肌细胞产品质量参差不齐。由多能干细胞分化的心肌细胞呈现的生理状态如形体结构结构、动作电位和钙运作能力等方面和成熟心肌细胞的生理状态相去甚远，心肌细胞质量的这些不足很大程度上限制其在临床研究中的应用。现阶段对多能干细胞分化为心肌细胞的方法的研究主要集中在如何提高心肌细胞分化效率，并没有针对如果改善心肌细胞的质量、促进心肌细胞成熟进行研究的技术方案。
技术实现思路
为了改善心肌细胞质量、促进心肌细胞成熟，本专利技术提供了一种心肌细胞制备方法，多能干细胞在单层二元胶体晶体的培养基底中分化成心肌细胞，其中，所述单层二元胶体由二氧化硅胶体颗粒和PMMA胶体颗粒制备而成，并且所述培养基底表面涂覆有生物胶。二元胶体晶体(BinaryColloidalCrystals,BCCs)是指两种不同的胶体颗粒有序组装而成的胶体晶体，这些不同的胶体颗粒既可以指仅大小不同的同种胶体颗粒，也可以是物质种类、表面性质、形状及大小均不相同的胶体颗粒。本专利技术研究者通过大量实验证明，由二氧化硅微粒和PMMA构成的单层二元胶体晶体能够使心肌细胞具有更加成熟的表型，将其用作多能干细胞分化心肌细胞的培养基底可以有效促进心肌细胞成熟，改善心肌细胞质量。优选的是，所述的心肌细胞制备方法中，心肌细胞制备方法包括以下步骤：用Matrigel涂覆在单层二元胶体晶体培养基底表面，将多能干细胞以0.2×106细胞/cm2的密度接种在多能干细胞培养基中于5％CO2、37℃的条件下培养；当诱导多能干细胞密度高于40％时，将多能干细胞培养条件更换为心肌细胞分化条件。所述单层二元胶体晶体培养基底在包被有生物胶的条件下，才能促进多能干细胞分化心肌细胞的过程中心肌细胞的成熟、稳定。进一步优选的是，所述的心肌细胞制备方法中，所述心肌细胞分化条件包括将多能干细胞在含有终浓度为7.5μM的CHIR99021的心肌细胞分化培养基I中培养48h，再用含有终浓度为2μM的IWR-1的心肌细胞分化培养基I继续培养72h，然后用心肌细胞分化培养基II培养48h以上，并每隔24h进行换液，其中，心肌细胞分化培养基I为RPMI1640培养基和无胰岛素B27以100:2的体积比混合均匀的培养基，心肌细胞分化培养基II为RPMI1640和含胰岛素的B27以100:2的体积比混合均匀的培养基。优选的是，所述的心肌细胞制备方法中，所述多能干细胞包括诱导多能干细胞和胚胎干细胞，两种多能干细胞在本专利技术实施例提供的培养基底中分化的心肌细胞都具有更成熟的表型。由二氧化硅和PMMA构成的单层二元胶体晶体在心肌细胞制备过程中能够促进心肌细胞成熟，但是构成BCCs的二氧化硅胶体颗粒和PMMA胶体颗粒的粒径及两种颗粒的含量影响BCCs促进心肌细胞成熟的程度。优选的是，所述心肌细胞制备方法中，用于制备单层二元胶体晶体的二氧化硅胶体颗粒的粒径为2μm，PMMA胶体颗粒的粒径为0.1μm，且所述二氧化硅胶体颗粒数量和PMMA胶体颗粒的数量比为1:330。进一步优选的是，所述心肌细胞制备方法中，用于制备单层二元胶体晶体的二氧化硅胶体颗粒的粒径为5μm，PMMA胶体颗粒的粒径为0.4μm，且所述二氧化硅胶体颗粒数量和PMMA胶体颗粒的数量比为1:160。本专利技术实施例提供的心肌细胞的制备方法能够制备具有成熟表征的心肌细胞，所述心肌细胞具有更好的电生理特性，本专利技术实施例提供的心肌细胞的制备方法能够促进多能干细胞分化的心肌细胞在药物筛选、疾病模型以及细胞治疗方面的应用。附图说明图1是由不同细胞培养基底制备的心肌细胞经α-tubulin和α-actinin免疫荧光染色后呈现的细胞形态；图2A是蛋白免疫印迹检测不同培养基底制备的心肌细胞中ssTnI和cTnI的表达量，图2B是成人心肌细胞和5PM培养基底制备的心肌细胞相对于对照组的两种蛋白的表达量；图3是对照组、2PM和5PM制备的心肌细胞的钙瞬变曲线，其中2PM和5PM的钙瞬变振幅远大于对照组心肌细胞的钙瞬变振幅。具体实施方式除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有如本专利技术实施例所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所使用的术语仅用于描述特定的实施例，并非旨在对本专利技术进行限制。<实施例1>单层二元胶体晶体的制备方法用超纯水制备二氧化硅胶体悬液和PMMA胶体悬液，将两种悬液混合均匀后沉积在用聚苯乙烯包被的限定区域的玻璃表面，待水分蒸发后，将形成的BCCs表面在200℃条件下加热1min，其中部分PMMA熔化以起到粘合颗粒、稳定BCCs结构的作用，将BCCs于紫外线下灭菌30min。本专利技术实施例用橡胶圈在用聚苯乙烯包被的玻璃表面限定直径为3cm的区域，也可以根据实际需要限定其他大小的区域，该区域用以形成单层BCCs。本专利技术实施例采用单层BCCs作为细胞培养基底，根据玻璃表面限定区域的面积和二氧化硅胶体颗粒的粒径计算限定区域内形成单层二氧化硅薄膜需要的二氧化硅胶体颗粒的数量；PMMA胶体颗粒的数量取决于二氧化硅胶体颗粒的粒径和数量，根据两种胶体颗粒的粒径和数量比对BCCs作为细胞培养基底分化的心肌细胞的影响，本专利技术实施例提供的单层二元胶体晶体中的两种微粒满足以下条件：当二氧化硅胶体颗粒的粒径为2μm，PMMA胶体颗粒的粒径为0.1μm时，所述二氧化硅胶体颗粒数量和PMMA胶体颗粒的数量比为1:330，由该条件制备的单层二元胶体晶体简称为2PM；当二氧化硅胶体颗粒的粒径为5μm，PMMA胶体颗粒的粒径为0.4μm时，所述二氧化硅胶体颗粒数量和PMMA胶体颗粒的数量比为1:160，由该条件制备的单层二元胶体晶体简称为5PM。<实施例2>单层二元胶体晶体结构参数的检测本专利技术实施例分别从粗糙度和润湿性来分析<实施例1>制备的单层二元胶体晶体呈现的性能。利用原子力显微镜(AFM)以0.5Hz的扫描率分析其粗糙度，在BCCs表面任选5个区域进行扫描，计算平均值；利用全自动接触角测量仪分析其接触角，接触角越低表示其亲水性高，表面易于贴附；接触角越高表示其表面疏水性越强；单层二元胶体晶体的性能参数如表1所示：表1，单层二元胶体晶体的粗糙度和润湿性二元胶体晶体性能参数5PM组2PM组粗糙度(nm)104.6173.2润湿性(°)51.7359.9<实施例3>心肌细胞制备方法采用<实施例1>制备的单层二元胶体晶体作为细胞培养基底用于制备心肌细胞，其中以玻片作为细胞培养基底作为对照组。用Matrigel包被单层二元胶体晶体及对照组的玻片，将多能干细胞以0.2×106细胞/cm2的密度接种在多能干细胞培养基中于5％CO2、37℃的条件下培养，其中多能干细胞培养基为TeSRTM-E8TM培养基。当多能干细胞密度高于40％时，将多能干细胞在含有终浓度为7.5μM的CHIR99021的心肌细胞分化培养基I中培养48h，再用含有终浓度为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心肌细胞制备方法，其特征在于，多能干细胞在单层二元胶体晶体的培养基底中分化成心肌细胞，其中，所述单层二元胶体由二氧化硅胶体颗粒和PMMA胶体颗粒制备而成，并且所述培养基底表面涂覆有生物胶。

【技术特征摘要】
1.一种心肌细胞制备方法，其特征在于，多能干细胞在单层二元胶体晶体的培养基底中分化成心肌细胞，其中，所述单层二元胶体由二氧化硅胶体颗粒和PMMA胶体颗粒制备而成，并且所述培养基底表面涂覆有生物胶。2.如权利要求1所述心肌细胞制备方法，其特征在于，心肌细胞制备方法包括以下步骤：用Matrigel涂覆在单层二元胶体晶体培养基底表面，将多能干细胞以0.2×106细胞/cm2的密度接种在多能干细胞培养基中于5％CO2、37℃的条件下培养；当诱导多能干细胞密度高于40％时，将多能干细胞培养条件更换为心肌细胞分化条件。3.如权利要求2所述心肌细胞制备方法，其特征在于，所述心肌细胞分化条件包括将多能干细胞在含有终浓度为7.5μM的CHIR99021的心肌细胞分化培养基I中培养48h，再用含有终浓度为2μM的IWR-1的心肌细胞分化培养基I继续培养72h，然后用心肌细胞分...

【专利技术属性】
技术研发人员：王嘉显，崔畅，徐轶冰，王倩，
申请(专利权)人：南京艾尔普再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32