Ghrelin活性剂用于诱导干细胞向软骨细胞分化制造技术

本发明专利技术提供包含ghrelin活性剂的组合物，和使用其诱导干细胞向软骨细胞分化的方法，具体地还提供使用其治疗骨关节炎的方法以及使用其治疗软骨损伤的方法。

【技术实现步骤摘要】
Ghrelin活性剂用于诱导干细胞向软骨细胞分化
本专利技术涉及包含ghrelin活性剂的组合物，和使用其诱导干细胞向软骨细胞分化的方法，具体地还涉及使用其治疗骨关节炎的方法，使用其治疗软骨损伤的方法，以及相应的用途。
技术介绍
随着社会人口老龄化和骨关节炎等疾病发病率的增加，软骨组织损伤已成为临床最常见的损伤之一。关节软骨无血管和神经，依靠关节液营养，一旦损伤不能自我修复。无论是通过组织工程还是再生医学的方法，高效获取大量软骨细胞都是软骨损伤治疗的核心问题。成年动物的软骨细胞是终末分化细胞，其来源有限，取材时创伤、难度大，体外增殖能力差，容易去分化而失去功能，难以满足作为软骨组织工程种子细胞的条件。间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是来源于中胚层的具有多向分化潜能的成体干细胞，可以分化成大多数细胞类型，包括骨、软骨、脂肪、肌肉等。MSC尤其是骨髓MSC(BMSC)出色的多向分化能力使其成为软骨组织工程和软骨再生医学中最有潜力的细胞来源。如何更好的理解MSC向软骨定向分化的机理，提高BMSC软骨方向分化的效率是目前科研工作的重要课题之一。当前广泛使用的诱导干细胞软骨分化培养基基于TGF-β和细胞浓集，TGF-β是一种有多种功能的生长因子，通过在细胞积聚条件下(小球(pellet)或微团(micromass)培养体系)添加软骨诱导培养基，诱导干细胞的软骨形成。这个方法确实能够诱导干细胞成软骨分化。物理手段、化学因子以及生物因子都被应用在提高成软骨分化效率中。物理手段如拓扑结构、力刺激和缺氧等。化学因子如小分子以及一些材料的化学特性等。生物因子主要是蛋白质和多肽，对于MSC成软骨分化是必须也是十分有用的。TGF-β能够通过SMAD途径起始成软骨分化。PHTrP能够抑制原代软骨细胞的肥大表型。BMP-2也是TGF-β超家族的一员，能够诱导成软骨分化和肥大。当然分阶段的添加不同的生长因子也是能够促进成软骨分化和之后的表型成熟的。然而就目前的技术手段来讲，该方法存在诱导效率低、加速软骨细胞肥大、诱导分化的软骨细胞中成软骨相关基因表达不高、软骨亚型混杂且多为生长盘软骨而非关节软骨，以及对于间充质干细胞向软骨细胞分化的不同阶段没有不同的分化策略等问题。Ghrelin也称饥饿激素，是1999年由Kojima在大鼠胃中发现的一种具有28个氨基酸的肠肽，被识别为生长激素促分泌素受体(growthhormonesecretagoguereceptor，GHS-R)的内源性配体(Kojima等人,1999)。它的生物活性主要是通过与其细胞表面特异性受体GHS-R(包括GHSR1α和GHSR1β两种亚型)相互作用来完成的。Ghrelin及其受体在外周组织及中枢神经系统中广泛分布,并发挥着重要的生物学作用,如促进生长激素的释放、增加食欲、调节能量代谢、抑制炎性反应及调节免疫功能等。
技术实现思路
本专利技术人出乎意料地发现，ghrelin能有效诱导干细胞向软骨细胞分化，并在此基础上完成了本专利技术。在一个方面中，本专利技术提供一种诱导分化组合物，其包含ghrelin活性剂和药学可接受的载体。在一个实施方案中，所述ghrelin活性剂是哺乳动物ghrelin如人ghrelin，或者是与ghrelin氨基酸序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％一致性并具有ghrelin活性的肽，优选地所述ghrelin活性剂在对应于ghrelin第1至5位氨基酸的位置具有与ghrelin相同的氨基酸。具体地，所述人ghrelin的氨基酸序列是GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQIDNO.1)。在一个替代实施方案中，所述ghrelin活性剂是哺乳动物ghrelin或人ghrelin，或者是哺乳动物ghrelin或人ghrelin经过替换、缺失或添加一个或更多个氨基酸并且具有ghrelin活性的肽，优选地所述ghrelin活性剂在对应于ghrelin第1至5位氨基酸的位置具有与ghrelin相同的氨基酸。在另一个实施方案中，所述ghrelin活性剂是非天然存在的形式，例如是化学或生物学方法合成的。另外，所述ghrelin活性剂可以是游离的或者是缀合物，例如与增加分子量的结构(如PEG、白蛋白或免疫球蛋白Fc段)相缀合。在另一个实施方案中，所述ghrelin活性剂在对应于人ghrelin第3位丝氨酸的位置上被辛酰化。在另一个实施方案中，所述诱导分化组合物还至少包含另一种分化诱导剂，优选地所述分化诱导剂选自I型胶原、BMP、TGF、FGF、IGF、WNT、GDF、kartogenin等具有软骨诱导活性的小分子中的一种或更多种，例如所述BMP选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9，例如是BMP-2和/或BMP-4，所述TGF选自TGF-α或TGF-β，例如是TGF-β，所述FGF选自FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10，例如是FGF-2，所述IGF选自IGF-1和IGF-2，例如是IGF-1，所述WNT选自WNT-3a、WNT-5a和WNT-7，和/或所述GDF选自GDF-5；更优选地所述分化诱导剂是TGF-β，特别是TGF-β3。在一个具体实施方案中，在所述组合物中，ghrelin活性剂和其他分化诱导剂可以在空间上物理分离，位于不同的区隔中。这可以方便地实现以不同方式施加ghrelin活性剂和其他分化诱导剂，例如在时间上先后添加不同的分化诱导剂。具体来说，先添加所述ghrelin活性剂，再添加所述其他分化诱导剂。或者先添加所述其他分化诱导剂，再添加所述ghrelin活性剂。在再一个实施方案中，所述诱导分化组合物是用于诱导分化的培养基或者培养基补充剂，或者是药物组合物。在第二个方面中，本专利技术提供一种抑制干细胞增殖的方法，其包括使所述干细胞暴露于本专利技术第一方面所述的诱导分化组合物。特别地，所述方法可以在体内和/或体外进行，也可以是通过内源性刺激干细胞自身产生ghrelin活性剂来实现。在第三个方面中，本专利技术提供一种诱导干细胞向软骨细胞分化的方法，其包括使所述干细胞暴露于本专利技术第一方面所述的诱导分化组合物。在第四个方面中，本专利技术提供一种增强或促进TGF-β诱导干细胞向软骨细胞分化之能力的方法，其包括在所述干细胞暴露于TGF-β之前、期间或之后，使所述干细胞暴露于本专利技术第一方面所述的诱导分化组合物。在第五个方面中，本专利技术提供一种产生软骨细胞的方法，其包括1)提供干细胞，和2)使所述干细胞暴露于本专利技术第一方面所述的诱导分化组合物并培养所述干细胞。在第六个方面中，本专利技术提供一种制备软骨组织的方法，其包括1)提供干细胞，和2)使所述干细胞暴露于本专利技术第一方面所述的诱导分化组合物并培养所述干细胞。在一个实施方案中，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导分化组合物，其包含ghrelin活性剂和药学可接受的载体。

【技术特征摘要】
1.一种诱导分化组合物，其包含ghrelin活性剂和药学可接受的载体。2.根据权利要求1的组合物，其中所述ghrelin活性剂是ghrelin或是与ghrelin氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性并具有ghrelin活性的肽，优选地所述ghrelin活性剂在对应于ghrelin第1至5位氨基酸的位置具有与ghrelin相同的氨基酸。3.根据权利要求1或2的组合物，其还至少包含另一种分化诱导剂，优选地所述分化诱导剂选自I型胶原、BMP、TGF、FGF、IGF、WNT、GDF和kartogenin中的一种或更多种；例如所述BMP选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9，例如是BMP-2和/或BMP-4，所述TGF选自TGF-α或TGF-β，例如是TGF-β，所述FGF选自FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10，例如是FGF-2，所述IGF选自IGF-1和IGF-2，例如是IGF-1，所述WNT选自WNT-3a、WNT-5a和WNT-7，和/或所述GDF选自GDF-5；更优选地所述分化诱导剂是TGF-β，特别是TGF-β3。4.根据权利要求1至3中任一项的组合物，其中所述组合物是用于诱导分化的培养基或者培养基补充剂，或者是药物组合物。5.一种抑制干细胞增殖的方法，其包括使所述干细胞暴露于根据权利要求1至4中任一项的组合物。6.一种诱导干细胞向软骨细胞分化的方法，其包括使所述干细胞暴露于根据权利要求1至4中任一项的组合物。7.一种增强或促进TGF-β诱导干细胞向软骨细胞分化之能力的方法，其包括在所述干细胞暴露于TGF-β之前、期间或...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛子钢，樊丽彤，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11