一种EBV病毒树鼩动物模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种EB病毒树鼩动物模型的建立方法，经过动物选择、病毒液制备、接种、观察树鼩状态、接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCs、qPCR测定PBMCs中EBV拷贝数、RT‑PCR检测PBMCs中EBV相关基因的表达、病理检测而建立的。本发明专利技术首次公开了树鼩EB病毒动物模型的建立方法，为更好的研究EB病毒生物学特性及其相关疾病打下基础；本发明专利技术中选用的树鼩为新型实验动物，其比目前已有的实验动物更加接近灵长类，其次树鼩对多种病毒具有易感性，具备易饲养、体积小、易获取等优点。

Establishment of an animal model of EBV virus tree shrew

The invention discloses a method for establishing an animal model of EBV tree shrew, which is established by animal selection, preparation of virus solution, inoculation, observation of tree shrew status, regular blood extraction after inoculation of tree shrew, separation of PBMCs, determination of EBV copy number in PBMCs by qPCR, detection of EBV-related gene expression in PBMCs by RT_PCR and pathological detection. The invention discloses for the first time a method for establishing animal model of EB virus in tree shrews, which lays a foundation for better research on biological characteristics of EB virus and related diseases; tree shrews selected in the invention are new experimental animals, which are closer to primates than existing experimental animals; secondly, tree shrews are susceptible to various viruses, and have the advantages of easy feeding, small size and easy access.

【技术实现步骤摘要】
一种EBV病毒树鼩动物模型的建立方法
本专利技术涉及动物模型制备领域，特别是涉及一种EBV病毒树鼩动物模型的建立方法。
技术介绍
EB病毒(Epstein–Barrvirus，EBV)是Epstein和Barr于1964年首次从非洲儿童Burkitt淋巴瘤的细胞中分离得到的。EBV在人群中的感染率高达90％，大多处于隐性即潜伏感染状态，人类通常在婴幼儿时期就被感染，并无临床症状的终生携带。EBV通过唾液传播，也可通过血液或性途径传播，其靶细胞为B淋巴细胞，其次为上皮细胞。研究表明，在体外EBV可激发B淋巴细胞永生化。EBV与多种恶性肿瘤的发生密切相关，包括鼻咽癌、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤、胃癌，国际癌症研究中心(IARC)对致癌因子进行分类，明确将其定位为I类致癌因子。此外EBV还与移植后淋巴细胞增殖性疾病、传染性单核细胞增多症、病毒相关性噬红细胞增多症等疾病的发生密切相关。目前还没有预防和治疗EBV感染的药物，对于EBV引起的相关恶性肿瘤，目前还得不到有效的防治或治疗。因此，构建EBV相关动物模型对于研究其生物学特性尤其是它在多种恶性肿瘤发生发展中的作用，以及疫苗与药物的研发至关重要。从发现EBV至今，国内外学者建立的EBV动物模型包括灵长类动物、严重联合免疫缺陷小鼠、转基因动物及兔子和豚鼠四大类。以上这些动物模型在研究EBV感染、致病机制及预防治疗等方面有着重要作用，但也各自存在一些不足。在研究人类特有的疾病方面，如能使用更为接近灵长类的动物模型，在整体水平上将具有不可替代的优势。新世界猴作为最上述动物模型中唯一的灵长类动物，本具有不可替代的优势，但新世界猴物种濒临灭绝，极其珍贵，以及保护政策、伦理学的要求限制了其在EBV动物模型中的继续使用，导致自20世纪90年代后EBV新世界猴动物模型的研究停滞不前。因此，建立一种更为实用、有效的EBV动物模型成为近年来研究EBV及其相关疾病的迫切要求。树鼩是一种生长于热带及亚热带地区的小型动物，属树鼩科，易饲养，寿命约8年。在我国，树鼩主要分布在云南、广西等地，近年来树鼩正越来越多的被科学家和生物医药领域采用。近期，中国科学院昆明动物研究所通过对树鼩全基因组、转录组及蛋白组的解析，证实了树鼩与灵长类的遗传特征接近，其在生理解剖、神经发育、及心理应激模式等方面与灵长类甚至人类之间存在高度的相似性。目前已有多项国内外研究表明，树鼩的许多病毒感染特性与人类相似，树鼩能被甲肝、乙肝、丙肝、轮状、腺、及疱疹等病毒感染。此外，树鼩作为耐药细菌感染和败血症、心理应激和抑郁症、近视及代谢性疾病等动物模型已成功建立。由此我们可以看出，树鼩作为一种新型的与灵长类更为接近的动物正得到密切的关注。研究表明，EBV的自然宿主范围仅为人类及包括棉顶狨猴，普通狨猴和猫头鹰猴等在内的新世界猴。由于树鼩与灵长类有着高度的相似特性，我们或许可以看到树鼩对于EBV的易感性以建立树鼩EBV动物模型的良好前景。以上
技术介绍
内容的公开仅用于辅助理解本专利技术的专利技术构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述
技术介绍
不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
技术实现思路
本专利技术目的在于提出一种EB病毒树鼩动物模型的建立方法，具体的技术方案如下：一种EBV病毒树鼩动物模型的建立方法，经过动物选择、病毒液制备、接种、观察树鼩状态、接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCs、qPCR测定PBMCs中EBV拷贝数、RT-PCR检测PBMCs中EBV相关基因的表达、病理检测而建立的。优选地，所述的动物选择，选取成年、健康树鼩13只(1-1.5年)，雌雄不限，体重为120-160g。优选地，所述的病毒液制备，由B95-8培养裂解产生，此细胞购自中国科学院上海细胞库。优选地，所述的接种，13只树鼩分为实验组(n＝10)及对照组(n＝3)，以Ts1-13表示，实验组经鼻腔滴鼻接种500μlEBV病毒液，约为3.9×108拷贝；对照组通过相同的方式接种500μl含10％FBS及1％双抗的RPMI1640培养基。优选地，所述的观察树鼩状态，接种后密切观察树鼩的状态，当其生命状态差(表现为不好动，常蜷缩在笼子一角、进食少或不进食及排便不正常等)时，及时处死以收集重要器官组织并分析出现状态差的原因。优选地，所述的接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCsA)定期抽血以“0，1，2…”周的方式记录接种前、后抽血时间，接种前抽血1次，接种后定期通过股动脉/股静脉抽血至含EDTA·2Na的抗凝采血管中。每次抽血尽量动作轻柔，保护动物；B)PBMCs的分离将1ml上述抗凝血(自抽取到分离时间＜4h)，小心的平铺到3mlPBMCs分离液液面上方，室温400g，离心20min后离心管由上至下分为4层，第二层白膜层即为单个核细胞层，收集细胞层至离心管中并加入PBS或细胞洗涤液充分混匀，室温250g，离心10min，反复重悬洗涤共3次后收集细胞(重悬备用)；优选地，所述的DNA及RNA的提取A)DNA提取将上述获取的细胞悬液分成2份，分别用来提取DNA及RNA。加1mlPBS重悬细胞，1000rpm离心7min，弃上清；加入20μl蛋白酶吹打混匀；加入200μlBufferAL，轻轻震荡15sec，56℃，水浴10min；轻微离心后加入200μl无水乙醇，微量振荡器振荡15sec；将混合液移入吸附柱中(吸附柱放置于2ml的收集管中)，室温下8000rpm离心1min；在吸附柱中加入500μlAW1，室温下8000rpm离心1min；在吸附柱中加入500μlAW2，室温下14000rpm离心3min；将吸附柱置于另一新的收集管中，室温下14000rpm离心1min；将吸附柱置于一新的1.5ml的EP管中，加入50μlBufferAE，室温放置2min，室温下8000rpm离心1min；测DNA浓度和纯度，样本置于-20℃保存；B)RNA提取将上述另一份细胞悬液于室温1000rpm离心7min，弃上清，加入1ml裂解液RZ，轻轻混匀；放置5min后，加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min后4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层，把最上层水相转移到新的EP管中；加入约250μl无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱中，4℃，12000rpm离心30sec；向吸附柱中加入500μl去蛋白液RD(使用前加入乙醇)，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30sec并重复1次，弃废液；将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min以去除残余液体；将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加30μlRNase-FreeddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min；测RNA浓度和纯度，置于-80℃保存。优选地，所述的qPCR测定PBMCs中EBV拷贝数，方法如下：以上述取得的DNA使用qPCR法测定PBMCs中EBV拷贝数，扩增的目的片段为EBV的BamHIW片段，如下：上游引物:5’-GCAGCCGCCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于，经过动物选择、病毒液制备、接种、观察树鼩状态、接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCs、qPCR测定PBMCs中EBV拷贝数、RT‑PCR检测PBMCs中EBV相关基因的表达、病理检测而建立的。

【技术特征摘要】
1.一种EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于，经过动物选择、病毒液制备、接种、观察树鼩状态、接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCs、qPCR测定PBMCs中EBV拷贝数、RT-PCR检测PBMCs中EBV相关基因的表达、病理检测而建立的。2.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的动物选择，选取成年、1-1.5年健康树鼩13只，雌雄不限，体重为120-160g。3.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的病毒液制备，由B95-8培养裂解产生。4.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的接种，13只树鼩分为实验组n＝10及对照组n＝3，以Ts1-13表示，实验组经鼻腔滴鼻接种500μlEBV病毒液，为3.9×108拷贝；对照组通过相同的方式接种500μl含10％FBS及1％双抗的RPMI1640培养基。5.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的观察树鼩状态，接种后密切观察树鼩的状态，当其生命状态差时，及时处死以收集重要器官组织并分析出现状态差的原因，所述生命状态差为表现为不好动，常蜷缩在笼子一角、进食少或不进食及排便不正常等。6.如权利要求1所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的接种树鼩后定期抽血，并分离PBMCs；A)定期抽血以“0，1，2…”周的方式记录接种前、后抽血时间，接种前抽血1次，接种后定期通过股动脉/股静脉抽血至含EDTA·2Na的抗凝采血管中，每次抽血尽量动作轻柔，保护动物；B)PBMCs的分离将1ml步骤A)抽取的抗凝血，小心的平铺到3mlPBMCs分离液液面上方，室温400g，离心20min后离心管由上至下分为4层，第二层白膜层即为单个核细胞层，收集细胞层至离心管中并加入PBS或细胞洗涤液充分混匀，室温250g，离心10min，反复重悬洗涤共3次后收集细胞，备用；C)DNA及RNA的提取将步骤B)获取的细胞悬液分成2份，分别用来提取DNA及RNA；a)DNA提取加1mlPBS重悬细胞，1000rpm离心7min，弃上清；加入20μl蛋白酶吹打混匀；加入200μlBufferAL，轻轻震荡15sec，56℃，水浴10min；轻微离心后加入200μl无水乙醇，微量振荡器振荡15sec；将混合液移入吸附柱中，室温下8000rpm离心1min；在吸附柱中加入500μlAW1，室温下8000rpm离心1min；在吸附柱中加入500μlAW2，室温下14000rpm离心3min；将吸附柱置于另一新的收集管中，室温下14000rpm离心1min；将吸附柱置于一新的1.5ml的EP管中，加入50μlBufferAE，室温放置2min，室温下8000rpm离心1min；测DNA浓度和纯度，样本置于-20℃保存；b)RNA提取将细胞悬液于室温1000rpm离心7min，弃上清，加入1ml裂解液RZ，轻轻混匀；放置5min后，加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min后4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层，把最上层水相转移到新的EP管中；加入约250μl无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱中，4℃，12000rpm离心30sec；向吸附柱中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30sec并重复1次，弃废液；将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min以去除残余液体；将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加30μlRNase-FreeddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min；测RNA浓度和纯度，置于-80℃保存。7.如权利要求6所述的EB病毒树鼩动物模型的建立方法，其特征在于：所述的qPCR测定PBMCs中EBV拷贝数，取得的DNA使用qPCR法测定PBMCs中EBV拷贝数，扩增的目的片段为EBV的BamHIW片段，如下：上游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐安洲，王芝，易翔，杜龙，周涛，祁承林，李恒，唐杰，王梦琳，赖永静，夏巍，
申请(专利权)人：广西医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：广西,45