一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法和装置，属于光学成像技术领域，通过普通的共聚焦显微技术对样品进行成像，得到样品在轴向位置的第一幅二维图像；然后，对入射的光束进行相位调制，得到中空的光束，使用中空的光束对样品进行共聚焦成像，得到该轴向位置的第二幅二维图像。然后使用盲卷积的算法，将两幅图像恢复。通过一个较小的相减系数，从恢复后图像减去第二幅图像，得到一个具有很小的负值较小的相减结果，将结果中的负值进行归零之后，可以得到该轴向位置的二维图像的最终结果。随后，改变成像的轴向位置，得到多幅二维图像，对这些图像进行三维重构。相减后产生的负值较小，减少了由于负值归零造成的有效信息的丢失。

【技术实现步骤摘要】
一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法和装置
本专利技术涉及光学成像
，具体地说，涉及一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法和装置。
技术介绍
1957年，美国科学家马文·闵斯基最早提出了共聚焦显微技术，并为其申请了专利，随着相关技术的发展，共聚焦显微技术也逐步发展成熟，目前已经成为生命科学领域最为常用的研究工具之一。虽然相较于传统的宽场显微技术，共聚焦显微技术在各个方向上的分辨率都有所提高，但是它仍旧无法突破衍射极限的限制。而随着生物研究的不断深入，对样品细微结构的研究需求，对光学显微镜的分辨率提出了更高的要求，促使了一系列超分辨显微成像技术的发展，如受激发射损耗荧光显微技术(STED)、基态耗尽显微技术(GSD)、可逆饱和光转移荧光显微技术(RESOLFT)、随机光学重建显微技术(STORM)等。以上显微技术虽然成功地突破了衍射极限，但也存在一定的缺点：它们的光学系统相对复杂、设备昂贵；只能对特定的荧光分子进行成像，对样品具有特定的要求；对样品的光漂白和光毒性较强。而差分的方法克服了上述的缺点，为共聚焦显微技术的分辨率提高提供了一种新的出路。在这种方法中，先后使用高斯光束和中空的光束对样品中的荧光进行激发，产生两个图像，再将这两幅图像以一定的相减系数做减法，得到最终的成像结果。这种方法的优势在于：它可以通过对原本的成像系统进行简单改造实现，成本较低；它的计算也十分简单，只需要进行简单的减法；它对荧光染料也没有特定的要求，适用范围更广。但是在两幅图像在相减的过程中，会产生一定的负值，随着分辨率提高，负值也会相应地增大。一般而言，我们将这些负值简单地归零，来避免最终结果中的负成像强度。但是，这种方法会丢失一部分有效信息，甚至可能造成最后成像结果的扭曲变形。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法，利用该方法可以减小普通差分方法中负值归零造成的信息丢失。本专利技术的另一目的为提供一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像装置，该装置用于实现上述差分共聚焦显微成像方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法包括以下步骤：1)激光光束进入共聚焦荧光显微镜光路中，通过振镜对样品进行轴向扫描，对样品各扫描位置进行成像，得到样品的二维共聚焦成像结果Iconfocal；2)在共聚焦荧光显微镜的照明光路中，对激光光束进行相位调制，在垂直于光轴的截面上形成中空光斑，利用步骤1)的方法得到样品的二维中空光束成像结果Idonut；3)使用盲卷积算法对二维共聚焦成像结果Iconfocal和二维中空光束成像结果Idonut进行恢复，得到恢复后的图像Irestored；4)使用相减系数αs，从图像Irestored中减去中空光束成像结果Idonut，并将得到的结果中的负值归零，得到最终二维图像Ifinal，即5)控制共聚焦荧光显微镜的物镜以一定的步长沿光轴移动，在每一个移动位置重复步骤1)～4)，得到相应移动位置的最终二维图像；6)将步骤5)中所有移动位置的最终二维成像结果进行三维重构，得到样品的三维成像结果。上述技术方案中，通过普通的共聚焦显微技术对样品进行成像，得到样品在轴向位置的第一幅二维图像；然后，对入射的光束进行相位调制，得到中空的光束，使用这个中空的光束对样品进行共聚焦成像，得到该轴向位置的第二幅二维图像。然后使用盲卷积的算法，将这两幅图像恢复，得到恢复的图像。通过一个较小的相减系数，从恢复后图像减去第二幅图像(即背景信号)，得到一个具有很小的负值较小的相减结果，将结果中的负值进行归零之后，就可以得到该轴向位置的二维图像的最终结果。随后，通过移动物镜，改变成像的轴向位置，得到多幅二维图像，对这些图像进行三维重构。这种方法，相减后产生的负值较小，减少了由于负值归零造成的有效信息的丢失。本专利技术的步骤2)中，可以使用空间光调制器或相位掩膜板对激光光束进行0-2π的涡旋相位调制。当使用空间光调制器对激光光束进行0-2π的涡旋相位调制时，空间光调制器的入射光路上设有满足空间光调制器对光束的偏振要求的偏振片，以满足空间光调制器对光束的偏振要求，激光器出射的光束经过单模光纤滤波之后，再经过准直透镜扩束，然后通过偏振片转化为线偏振光，入射到空间光调制器上。且入射到空间光调制器上的偏振光束的入射方向与调制平面的法线方向之间的夹角小于5°，经过空间光调制器进行相位调制后的激光光束，沿光路被物镜聚焦到样品上。使用空间光调制器进行相位调制，为了获得步骤1)中的共聚焦成像结果Iconfocal，需要在空间光调制器上加载一个全部为0相位的图案；为了获得步骤2)的中空光束成像结果Idonut，需要在空间光调制器上加载一个0-2π的涡旋相位图案，在成像过程中，通过控制器控制这两个图案的图像切换。当使用相位掩膜板对激光光束进行0-2π的涡旋相位调制时，在激光光束的光路上设置两个偏振分束镜，激光光束经过第一个偏振分束镜时，垂直偏振光被反射，平行偏振光穿过，被反射的垂直偏振光被相位掩模板调制成中空光束；平行偏振光与垂直偏振光在第二个偏振分束镜处进行合束。在垂直偏振光和平行偏振光的光路中各加入一个控制光路通断的电控开关。激光光束经过第一个偏振分束镜，垂直偏振光(s光)被反射，平行偏振光(p光)穿过。被反射的垂直偏振光(s光)被具有0-2π涡旋的相位分布的相位掩模板调制，然后到达第二个偏振分束镜，被该分束镜反射，穿过第一个偏振分束镜的平行偏振光(p光)，穿过第二个偏振分束镜。为了获得步骤1)中的共聚焦成像结果Iconfocal，需要打开平行偏振光(p光)路中的电控开关，同时关闭垂直偏振光(s光)路中的电控开关；为了获得步骤2)的中空光束成像结果Idonut，需要打开垂直偏振光(s光)路中的电控开关，同时关闭平行偏振光(p光)路中的电控开关，通过控制器对这两路开关的控制，实现高斯光束和中空光束的切换。步骤3)中，使用盲卷积算法对二维共聚焦成像结果Iconfocal和二维中空光束成像结果Idonut进行恢复的迭代过程如下：其中，o1表示通过二维共聚焦成像结果恢复得到的物的结果，o2表示通过二维中空光束成像结果恢复得到的物的结果，o表示将共聚焦和中空光束成像联合恢复的结果，or是o沿着中心转动180°的结果；psfc表示共聚焦的点扩散函数，psfcr是psfc沿着中心转动180°的结果；psfd是中空光束的点扩散函数，psfdr是psfd沿着中心转动180°的结果；Iconfocal是步骤1)中得到的二维共聚焦的成像结果，Idonut是步骤2)中得到的二维中空光束的成像结果；t表示迭代的次数；normalized表示归一化计算。通过一定次数的迭代后，得到的o的强度分布就是最后恢复的得到的结果，也即Irestored＝o。步骤4)中，选择的相减系数αs远小于传统的差分方法中的相减系数，可以极大地减小相减产生的负值，避免了在之后归零过程中，产生大量的有效信息的丢失。本专利技术提供的基于算法恢复的差分共聚焦显微成像装置，可用于实现上述差分共聚焦显微成像方法，其包括发出激光光束的光源，沿激光光束的光路上依次设有：光源，发出激光光束；相位调制组件，对激光光束进行相位调制；二向色镜，将激光光束分出一条探测光路，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)激光光束进入共聚焦荧光显微镜光路中，通过振镜对样品进行轴向扫描，对样品各扫描位置进行成像，得到样品的二维共聚焦成像结果Iconfocal；2)在共聚焦荧光显微镜的照明光路中，对激光光束进行相位调制，在垂直于光轴的截面上形成中空光斑，利用步骤1)的方法得到样品的二维中空光束成像结果Idonut；3)使用盲卷积算法对二维共聚焦成像结果Iconfocal和二维中空光束成像结果Idonut进行恢复，得到恢复后的图像Irestored；4)使用相减系数αs，从图像Irestored中减去中空光束成像结果Idonut，并将得到的结果中的负值归零，得到最终二维图像Ifinal，即

【技术特征摘要】
1.一种基于算法恢复的差分共聚焦显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：1)激光光束进入共聚焦荧光显微镜光路中，通过振镜对样品进行轴向扫描，对样品各扫描位置进行成像，得到样品的二维共聚焦成像结果Iconfocal；2)在共聚焦荧光显微镜的照明光路中，对激光光束进行相位调制，在垂直于光轴的截面上形成中空光斑，利用步骤1)的方法得到样品的二维中空光束成像结果Idonut；3)使用盲卷积算法对二维共聚焦成像结果Iconfocal和二维中空光束成像结果Idonut进行恢复，得到恢复后的图像Irestored；4)使用相减系数αs，从图像Irestored中减去中空光束成像结果Idonut，并将得到的结果中的负值归零，得到最终二维图像Ifinal，即5)控制共聚焦荧光显微镜的物镜以一定的步长沿光轴移动，在每一个移动位置重复步骤1)～4)，得到相应移动位置的最终二维图像；6)将步骤5)中所有移动位置的最终二维成像结果进行三维重构，得到样品的三维成像结果。2.根据权利要求1所述的差分共聚焦显微成像方法，其特征在于，步骤2)中，使用空间光调制器对激光光束进行0-2π的涡旋相位调制。3.根据权利要求2所述的差分共聚焦显微成像方法，其特征在于，在所述空间光调制器的入射光路上设有满足空间光调制器对光束的偏振要求的偏振片，且入射到所述空间光调制器上的偏振光束的入射方向与调制平面的法线方向之间的夹角小于5°。4.根据权利要求1所述的差分共聚焦显微成像方法，其特征在于，步骤2)中，使用相位掩膜板对激光光束进行0-2π的涡旋相位调制。5.根据权利要求4所述的差分共聚焦显微成像方法，其特征在于，在激光光束的光路上设置两个偏振分束镜，激光光束经过第一个偏振分束镜时，垂直偏振光被反射，平行偏振光穿过，被反射的垂直偏振光被相位掩模板调制成中空光束；平行偏振光与垂直偏振光在第二个偏...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，王晓娜，黎文柔，刘旭，李海峰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33