一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种中小分子量燕麦β–葡聚糖的制备方法和应用。所述的制备方法包括使用酶对底物进行酶解反应；其中：所述的酶包括β–葡聚糖内切酶和/或β–葡聚糖外切酶，所述的底物包括待酶解燕麦β–葡聚糖，所述底物的浓度为0.5％～10％，所述的百分比为质量百分比；所述酶与所述底物的质量比为1:(100～100000)；所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为60000道尔顿以下。本发明专利技术首次发现燕麦β‑葡聚糖具有促进HaCaT细胞中caspase‑14基因表达的作用，且分子量越小的燕麦β‑葡聚糖在促进HaCaT细胞中caspase‑14基因表达上效果越好。

【技术实现步骤摘要】
一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用
本专利技术属于药物化学领域，具体涉及一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用。
技术介绍
燕麦(拉丁学名：AvenasativaL.)为禾本科植物,《本草纲目》中称之为雀麦、野麦子。燕麦耐寒、抗旱，对土壤的适应性很强，能自播繁衍。当前燕麦的谷粒供磨面食用，麸皮主要用作饲料，已经有部分麸皮用于提取燕麦β-葡聚糖，用于新资源食品，但占比不高，本专利技术通过新的发现及工艺，对燕麦β-葡聚糖做了深层次的开发和利用，进一步拓宽了燕麦副产品的应用范围，增加了其社会及经济价值。北纬41°～43°是世界公认的燕麦黄金生长纬度带，那里是海拔1000米以上高原地区，年均气温2.5℃，日照平均可达16小时，是燕麦生长的最佳自然环境。燕麦在中国种植历史悠久，遍及各山区、高原和北部高寒冷凉地带。种植燕麦有210个县，集中产区是内蒙古自治区的阴山南北，河北省阴山和燕山地区，山西省朔州西山山区、太行山和吕梁山区，陕、甘、宁、青的六盘山、贺兰山和祁连山，云、贵、川的大、小凉山高海拔地区。近这些年来，全国播种面积1500万亩，在新品种的不断推广和栽培技术水平的提高，平均亩产从50公斤提高到75公斤。燕麦中的β-(1→3，1→4)葡聚糖简称燕麦β-葡聚糖，是存在于燕麦胚乳和糊粉层细胞壁(即麸皮)的一种非淀粉多糖。它由单体β-D-吡喃葡萄糖，通过β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键连接起来形成的一种高分子聚合物。在燕麦胚乳和糊粉层细胞壁成分中，β-葡聚糖占85％以上。燕麦β-葡聚糖是一种相对分子质量较小的短链葡聚糖，市售燕麦β-葡聚糖粉及燕麦β-葡聚糖溶液平均相对分子质量约为130000～180000道尔顿。Caspase是一组半肌氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，均为半肌氨酸蛋白酶类，并且都具有特异性天冬氨酸酶切位点，故又称为Caspase蛋白酶家族。Caspase蛋白酶家族还具有以下共同特征：均含有保守的OACRG五肽序列，常以异构体的形式存在，通常以无活性的酶原形式存在，须通过水解其氨基端一段序列而被激活。活化的Caspase可水解底物并通过级联放大效应及诱发凋亡。至今发现的Caspase蛋白酶家族共有14种，Caspase-14属于其中的一员，其基因的翻译片段总长度约为2.4kb共编码257个氨基酸，体内存在形式为Caspase-14酶原。人类的Capase-14定位于染色19p13.1，具有皮肤特异性，主要分布在表皮角质层和颗粒层、表达于具有角化倾向的上皮组织。在皮肤中，仅表达于处于分化阶段的KC，尤其在分化的最终阶段发挥活性作用。但也有资料显示Caspase-14在毛囊和皮脂腺可少量出现。Caspase-14具有组织特异性，主要在维持表皮的稳态平衡中发挥重要作用。KC特有的Caspase-14主要功能是参与细胞终末分化，形成完整角质层，发挥皮肤屏障的作用。Caspase-14(半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14)是反映皮肤屏障功能的重要因子。它轻度的表达下降可能导致角质层持水量降低，皮肤干燥，诱发多种皮肤亚健康状况；严重的表达缺陷则可导致角质层NMF的严重不足，角质层脱水，影响皮肤的屏障功能，诱发各种皮肤病。角质形成细胞在分化为表皮颗粒层细胞时首先表达Faliggrin前体——丝聚合蛋白原(proiflaggrin)并被磷酸化，形成不溶性的聚合物存在于透明角质颗粒中；随角质细胞分化为角质形成细胞，丝聚合蛋白原去磷酸化并降解成为可溶性的Faliggrin，在新形成的角质层最内层2～3层的角质形成细胞内，Faliggrin可达总蛋白的25％以上；随着角质形成细胞成熟，Faliggrin进一步被蛋白酶降解生成大量的NMF。Caspase-14是催化Filaggrin降解的关键酶，因而是NMF生成的关键酶。Filaggrin首先被Caspase-14迅速降解为中间短肽，进而水解成各种天然保湿因子。Caspase-14仅表达于颗粒层和新形成的角质层角质形成细胞中，与profilaggrin和兜甲蛋白(loricrin)一样是角质形成细胞晚期分化的代表性标志蛋白，Caspase-14的基因缺陷则导致profilaggrin降解异常，NMF产生不足。特应性皮炎(atopicdermatitis,AD)与Caspase-14基因突变密切关联，AD患者的角质层中的Filaggrin与Casepase-14表达强度都有减少，生成的NMF量也随之降低，这是引起AD患者皮肤干燥的重要因素之一，因此Filaggrin与Casepase-14在AD发病中扮演着重要的角色。Caspase-14是Filaggrin生成的关键酶，间接影响自由氨基酸与天然保湿因子的产生,在寻常型鱼鳞病的发生过程中起着重要的作用。银屑病患者皮损处Filaggrin的表达下降同时Caspase-14的表达缺陷，产生的NMF减少，出现皮肤干燥、角化明显现象，可能是由于长期慢性炎症反复发作，导致患者体内Filaggrin及Caspase-14基因表达异常，出现降低现象。研究发现老年皮肤Filaggrin及Caspase-14的表达量显著降低，造成NMF的生成不足，紫外线也可破坏角质细胞内Caspase-14基因表达，影响Faliggrin降解生成NMF的过程，从而使内源性的NFM生成不足，这可能是自然老化和光老化皮肤干燥的重要原因之一。随着社会的发展，人们亟待专利技术、发现安全有效的物质，来实现对抗皮肤疾病及光衰老。基于现代分子生物学的研究手段，人们不断的研制各类能够用于对抗光老化、预防和治疗各类因基因表达缺陷或表达不足，导致的各类皮肤疾病的药物。由于燕麦β-葡聚糖的特殊结构，利用酶法检测(AOACMethod995.16)，具有很强的专一性，具体原理为：利用lichenase地衣酶(专一性的(1-3)-β-糖苷键,(1-4)-β-糖苷键内部4-葡聚糖水解酶EC3.2.1.73)进行第一步酶水解，水解后的寡糖利用β-葡聚糖酶(EC3.2.1.21)进行第二步水解。这种方法具有很强的专一性，除了(1-3),(14)-β-葡聚糖外，其它的多糖都不会被水解。最后用GOPOD葡萄糖检测试剂检测生成的多糖含量，定性定量检测燕麦β-葡聚糖。然而利用该方法进行燕麦β-葡聚糖的水解具有中小分子量燕麦β-葡聚糖产率低的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏能够提高caspase-14基因表达的物质、且获得中小分子量的燕麦β-葡聚糖的方法产量低等缺陷，提供一种中小分子量燕麦β-葡聚糖的制备方法和应用。所得到的中小分子量燕麦β-葡聚糖可以有效促进caspase-14基因的表达，发挥其直接的皮肤靶向作用，并可用于治疗和预防因caspase-14基因表达缺陷所导致的疾病，以及因紫外照射所导致的皮肤光老化疾病。本专利技术研究发现，自然存在的燕麦β-葡聚糖，对HaCaT细胞中caspase-14基因表达具有一定的促进作用，但其效果非常不明显；经本专利技术团队研究发现，小分子量的燕麦β-葡聚糖对HaCaT细胞中caspase-14基因表达具有明显的促进作用。然而自然界存在的小分量燕麦β-葡聚糖的量是极其微量的。直接从燕麦中分离小分子量燕麦β-葡聚糖，存在存量低本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中小分子量燕麦β–葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括使用酶对底物进行酶解反应；其中：所述的酶包括β–葡聚糖内切酶和/或β–葡聚糖外切酶，所述的底物包括待酶解燕麦β–葡聚糖，所述底物的浓度为0.5％～10％，所述的百分比为质量百分比；所述酶与所述底物的质量比为1:(100～100000)；所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为60000道尔顿以下。

【技术特征摘要】
1.一种中小分子量燕麦β–葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括使用酶对底物进行酶解反应；其中：所述的酶包括β–葡聚糖内切酶和/或β–葡聚糖外切酶，所述的底物包括待酶解燕麦β–葡聚糖，所述底物的浓度为0.5％～10％，所述的百分比为质量百分比；所述酶与所述底物的质量比为1:(100～100000)；所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为60000道尔顿以下。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为30000道尔顿以下；较佳地，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量为10000道尔顿以下；更佳地，所述的中小分子量燕麦β–葡聚糖的分子量342.32～1000道尔顿；和/或，所述底物的浓度为1％～5％，所述的百分比为质量百分比；和/或，所述酶与所述的底物的质量比为1:(1000～10000)，较佳地为1:5000；和/或，所述酶解反应的pH为3.0～9.0，较佳地为4.5～6.5，更佳地为5.0；和/或，所述酶解反应的温度为20～80℃，较佳地为45～65℃，更佳地为50℃；和/或，所述酶解反应的时间为0.1～10小时，较佳地为0.5～2小时；和/或，所述酶解反应中，以水为载体；和/或，所述的酶为纤维素酶或者β-葡聚糖酶。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进行所述酶解反应后还进行以下操作：对所述酶解反应后所得产物进行分子量分级，保留所述产物中的中小分子量燕麦β-葡聚糖、并将所述产物中分子量大于所述中小分子量燕麦β-葡聚糖的燕麦β–葡聚糖再次进行酶解反应；较佳地，所述的操作重复1次以上；更佳地，所述的操作重复2～4次。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的分级方法为沉淀、超滤、分子筛或者层析。5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述酶解反应所...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟春涛，卢向艳，金敏蓉，王风楼，
申请(专利权)人：上海晟薇生物科技有限公司，莱博药妆技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31