一种抗HB-EGF单克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗HB‑EGF单克隆抗体及其制备方法。本发明专利技术所述抗HB‑EGF单克隆抗体的制备方法是用纯化后的HB‑EGF蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，提取免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞，通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌抗HB‑EGF的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得抗HB‑EGF单克隆抗体，本发明专利技术的抗HB‑EGF单克隆抗体可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，所获抗体经验证具有良好的特异性结合能力。

【技术实现步骤摘要】
一种抗HB-EGF单克隆抗体及其制备方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种抗HB-EGF单克隆抗体及其制备方法。
技术介绍
人表皮生长因子受体（HER）家族包括被命名为HER-1（ErbB1）、HER-2（ErbB2）、HER-3（ErbB3）和HER-4（ErbB）在内的4种不同的酪氨酸激酶受体。这些受体在多数表皮细胞、间质细胞及肿瘤细胞内均存在表达，如HER-1和HER-2被发现在上皮来源和间质来源的子宫恶性肿瘤中存在高表达，研究已发现在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌及肾癌等多种癌症中均存在HER-1的异常激活和过表达现象，HER-3在HER-2阳性乳腺癌患者体内的表达情况与乳腺癌治疗的预后不良存在相关性。肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）为表皮生长因子家族中的一员，可与HER结合，以旁分泌、自分泌、近分泌的形式发挥其生物活性，在无配体结合状态下，HER通常以单体的形式存在于细胞膜表面。当它的胞外区与配体结合时，如HB-EGF，会激活一系列信号通路，启动信号转导级联反应，刺激肿瘤细胞增殖，并抑制细胞凋亡，广泛参与如伤口愈合、胚胎植入、心脏发育等生理过程和动脉粥样硬化、脑损伤、肿瘤发生等众多病理进程，而应用小分子抑制剂或单克隆抗体阻断相关信号通路则可逆转该过程。大量研究表明，HB-EGF可促进肿瘤细胞增殖和血管新生，增强癌细胞增殖、黏附、侵袭的能力。近年来，HB-EGF被发现在一些癌症中或可作为早期检测和不良预后的肿瘤标志物。但是目前HB-EGF抗体存在特异性差，产量低的缺点，限制了HB-EGF的应用，因此，继续开发一种高特异性、高亲和性、高产量的HB-EGF抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种抗HB-EGF单克隆抗体、其制备方法及其应用。本专利技术利用HB-EGF蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术将免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合筛选能够稳定分泌抗HB-EGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量生产HB-EGF单克隆抗体，经纯化后获得高纯度的HB-EGF单克隆抗体，对进一步研究以HB-EGF为靶点的生物诊断及治疗药物等方面具有重要的意义。本专利技术的方案通过如下技术手段得以实现：本专利技术首先提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体为抗HB-EGF单克隆抗体，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，轻链可变区序列氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本专利技术还提供所述抗HB-EGF单克隆抗体的制备方法，本专利技术首先用HB-EGF蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗HB-EGF单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗HB-EGF单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗HB-EGF单克隆抗体。所述蛋白免疫为经过三次蛋白免疫；所述骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞。本专利技术还提供所述抗HB-EGF单克隆抗体的应用，所述应用为制备ELISA试剂盒。本专利技术所述抗HB-EGF单克隆抗体的应用，具体为用于免疫学检测，具体的为检测HB-EGF蛋白。本专利技术的有益效果：HB-EGF的异常表达现象存在于如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等多种癌症中，其可通过与相应的受体HER结合，干预多条细胞信号转导通路，促进癌细胞的增殖、黏附、侵袭及实体瘤的发展。本专利技术得到的抗HB-EGF单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价均达到1×108以上。本专利技术所得到的抗HB-EGF单克隆抗体能够特异性的结合HB-EGF蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，也可能对进一步开发以HB-EGF为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。附图说明图1为重组蛋白HB-EGF组分收集的SDS-PAGE电泳图。图2为纯化后的HB-EGF单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图。图3为不同稀释度HB-EGF单克隆抗体的免疫效价检测结果。图4为HB-EGF单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果。图5为HB-EGF单克隆抗体对HB-EGF重组质粒瞬时转染的293A细胞进行Westernblot实验结果。图6为HB-EGF单克隆抗体对HB-EGF重组质粒瞬时转染293A细胞进行免疫荧光染色实验结果。图7为HB-EGF基因工程抗体的特异性鉴定结果。具体实施方式以下结合实施案例来进一步解释本专利技术，但实施案例并不对本专利技术做任何形式的限定。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料。实施例1：HB-EGF单克隆抗体制备（1）重组HB-EGF蛋白的表达与纯化a.转化大肠杆菌BL21表达目标重组蛋白重组质粒pET-30a-HB-EGF（购自Invitrogen公司），采用42℃热激90s的方法将重组质粒转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在500mLLB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时，加入0.5mMIPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。b.重组蛋白纯化将菌体裂解液上清加入镍柱层析柱中（购自Novagen），4℃结合过夜，弃去上清，用WashBuffer缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白，然后用10倍柱体积的500mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，如图1所示，图中从左往右依次为第一、二、三依次洗脱的HB-EGF蛋白，蛋白经五次洗脱即能获得较高的纯度，收集第五次洗脱后的蛋白，冻干后进行后续动物免疫。（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。a.首次免疫：取重组HB-EGF蛋白100μg，添加PBS稀释到200μL，加入200μL的弗氏完全佐剂，充分乳化成黏厚的乳剂，腹部皮下多点注射，完成首次免疫。b.第二次免疫：首次免疫间隔三周后，取同样的重组HB-EGF蛋白100μg，添加PBS稀释到200μL，加入等体积的弗氏不完全佐剂，充分乳化成黏厚的乳剂，腹部皮下多点注射，完成第二次免疫。c.利用间接ELISA法检测第二次免疫后小鼠血清效价：取出重组HB-EGF蛋白，用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将HB-EGF蛋白稀释为1μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000g离心15min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100μL1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自JacksonImmunoResearch公司），37℃孵育30min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100μLTMB底物显示液，37℃避光显色10~15min，随后加入50μL终止液终止反应，于酶标仪450n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体为抗HB‑EGF单克隆抗体，所述轻链可变区如SEQ . ID.NO. 2所示，重链可变区如SEQ .ID.NO. 1所示。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体为抗HB-EGF单克隆抗体，所述轻链可变区如SEQ.ID.NO.2所示，重链可变区如SEQ.ID.NO.1所示。2.一种权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，首先用HB-EGF蛋白免疫小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗HB-EGF单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的小鼠腹腔，大量生产抗HB-EGF单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗HB-EGF单克隆抗体。3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晗青，屠志刚，
申请(专利权)人：江苏莱森生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32