本发明专利技术属于组织工程技术领域，具体涉及一种以类角膜上皮细胞为种子细胞构建组织工程化角膜上皮的方法与应用。本发明专利技术提供了一种采用两步法诱导皮肤来源的表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞，以诱导获得的类角膜上皮细胞为种子细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程化角膜上皮，制得的组织工程化角膜上皮，具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点，可用于移植修复人类或动物因角膜缘干细胞缺损导致视力严重下降或失明的眼表，用于因角膜缘干细胞缺损而失明的动物模型的自体移植和同种异体移植均能取得良好的效果。
【技术实现步骤摘要】
一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用
本专利技术属于组织工程
，具体涉及一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用。
技术介绍
根据调查统计，在我国角膜盲约占双眼盲患者15.38％，已成为第二位致盲性眼病。我国角膜盲病人每年约400万（包括单眼患者），这些病人中75％以上可以通过角膜移植达到复明的目的。由于角膜供体严重匮乏，我国每年仅有4000例左右手术机率，只占病人的2‰。构建可用于人体移植的组织工程角膜满足患者需求，成为迫切需要解决的医学难题。以非角膜来源的自体组织干细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程角膜上皮是解决这一医学难题的理想选择。国内外学者进行了口腔粘膜上皮细胞、骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞和胚胎干细胞诱导分化为角膜上皮细胞的研究，试图解决这一难题[NishidaK，etal.2004,NEnglJMed;351(12):1187–1196;GaoN,etal.2007,SciChinaCLifeSci;50(1):101-110;YangXY,etal.2008,MolVis;14:1064-1070;MaY,etal.2006,StemCells;24(2):315–321;Meyer-BlazejewskaEA,etal.2011,StemCells;29（1）:57-66]，这些研究结果表明多种组织干细胞在特定诱导条件下可以转分化为角膜上皮细胞，并促进LSCD眼表修复。但、由于成体干细胞在组织中数量极少、又缺乏特异性分子标记，因此，很难分离分化纯化建立细胞系（WattFM,etal.2010,Phil.Trans.R.Soc.B;365:155-163）。皮肤是人类和动物最大的器官，有丰富的细胞来源、如果能将皮肤表皮干细胞诱导成为角膜细胞，并作为组织工程角膜上皮的种子细胞，则能解决这一难题。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种类角膜上皮细胞的制备方法，该方法可诱导皮肤表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的类角膜上皮细胞。本专利技术的再一目的在于提供一种组织工程化角膜上皮，该角膜上皮采用上述类角膜上皮细胞替代角膜缘干细胞构建得到。本专利技术的第四个目的在于提供上述类角膜上皮细胞和组织工程化角膜上皮的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种类角膜上皮细胞的制备方法，包含如下步骤：（1）将人或哺乳动物皮肤表皮细胞，采用含终浓度为30～50μg/mLEGF和20～30ng/mLLIF的无血清培养基诱导培养10～24h，使表皮细胞去分化、回到较原始的状态，得到去分化的表皮细胞；（2）将步骤（1）制得的去分化的表皮细胞与人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞采用transwell共培养系统进行共培养，培养3～5天，使去分化的表皮细胞向角膜上皮细胞分化，得到类角膜上皮细胞；步骤（1）中所述的人或哺乳动物皮肤表皮细胞可来源于成体皮肤组织，可以通过如下方式获得：无菌采取0.3～0.5cm×0.8～1.2cm大小的成人颈部皮肤或哺乳动物（主要包括宠物，家畜和珍稀野生动物）耳缘皮肤，用酶消化法分离纯化表皮细胞，用无血清培养基进行扩增，并对所获得细胞进行CK14、P63、integrin-β1等表皮细胞的标志蛋白免疫组织化学检测，均为阳性，证明所使用的细胞具表皮细胞特征；其中，无血清培养基的组分优选为：F12+1～1.2%BSA+20～25ng/mLEGF+2.5μg/mLinsulin+10～15ng/mLIGF-1+0.4～0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素；步骤（1）中所述的含终浓度为30～50μg/mLEGF和20～30ng/mLLIF的无血清培养基的组分优选为：F12+1～1.2%BSA（牛血清白蛋白，体积分数）+30～50ng/mLEGF（表皮细胞生长因子）+20～30ng/mLLIF（白细胞抑制因子）+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素；步骤（1）中所述的诱导培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和适度；步骤（1）中所述的诱导培养的时间优选为20～24h；步骤（2）中所述的人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞优选为商品化的人或哺乳动物的角膜基质成纤维细胞，或原代培养的人或哺乳动物的角膜基质成纤维细胞；步骤（2）中所述的共培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和适度；一种类角膜上皮细胞，通过上述制备方法制备得到；所述的类角膜上皮细胞在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用；一种组织工程化角膜上皮，由上述类角膜上皮细胞构建得到；所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，包含如下步骤：将上述类角膜上皮细胞接种至去上皮细胞的人羊膜（Humanamnioticmembrane，HAM）支架上，用无血清培养基培养，第1～5天为浸没培养，随后进行气-液界面培养（减少培养液的添加量、使培养物暴露于空气界面）；培养14～16天后，得到组织工程化角膜上皮；所述的无血清培养基包含如下组分：F12+1～1.2%BSA（牛血清白蛋白，体积分数）+20～25ng/mLEGF（表皮细胞生长因子）+2.5μg/mLinsulin+10～15ng/mLIGF-1+0.4～0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素；所述的浸没培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和湿度，每两天换液；所述的气-液界面培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和湿度，每天换液；所述的去上皮细胞的人羊膜支架的制备方法，包含如下步骤：（1）无菌条件下，将带有羊膜的胎膜囊放入含有青霉素、链霉素的生理盐水中，顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；（2）将剥离下的羊膜分别用生理盐水和含青霉素、链霉素的PBS冲洗，然后顿性剥离海绵层；（3）将去除海绵层的羊膜采用PBS冲洗，然后加入含0.1～0.4wt%胰酶和0.05～0.2wt%EDTA的消化液中，经8～24h消化去除上皮细胞；（4）将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺，将醋酸纤维素膜（NC膜）剪成中空的支架附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上，然后36～38℃放置30～120min，得到去上皮细胞的人羊膜支架；步骤（1）中所述的羊膜为取自经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖腹产分娩产妇的胎儿胎盘；步骤（1）中所述的顿性剥离优选采用细胞刮以及角膜镊；步骤（2）中所述的生理盐水冲洗的具体操作优选为：将剥离下的羊膜用生理盐水反复冲洗，直至血液及其他污物被彻底清洗掉；步骤（2）中所述的含青霉素、链霉素的PBS冲洗的次数优选为3～5次；步骤（3）中所述的消化的温度优选为2～5℃；步骤（3）中所述的消化的温度优选为4℃；步骤（4）中所述的放置的温度优选为37℃；所述的组织工程化角膜上皮在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用；本专利技术提供了一种采用两步法诱导皮肤来源的表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞的新方法，以诱导获得的类角膜上皮细胞为种子细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程化角膜上皮，类角膜上皮细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的组织工程化角膜上皮。该组织工程化角膜上皮经透射电镜观察，诱导的类角膜上皮本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于包含如下步骤：（1）以人或哺乳动物皮肤表皮细胞为种子细胞，采用含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mL LIF的无血清培养基诱导培养10～24h，使表皮细胞去分化、回到较原始的状态，得到去分化的表皮细胞；（2）将步骤（1）制得的去分化的表皮细胞与人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞采用transwell共培养系统进行共培养，培养3～5天，使皮肤表皮细胞向角膜上皮细胞分化，得到类角膜上皮细胞。
【技术特征摘要】
1.一种类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于包含如下步骤：（1）以人或哺乳动物皮肤表皮细胞为种子细胞，采用含终浓度为30～50μg/mLEGF和20～30ng/mLLIF的无血清培养基诱导培养10～24h，使表皮细胞去分化、回到较原始的状态，得到去分化的表皮细胞；（2）将步骤（1）制得的去分化的表皮细胞与人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞采用transwell共培养系统进行共培养，培养3～5天，使皮肤表皮细胞向角膜上皮细胞分化，得到类角膜上皮细胞。2.根据权利要求1所述的类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的含终浓度为30～50μg/mLEGF和20～30ng/mLLIF的无血清培养基的组分为：F12+1～1.2%BSA+30～50ng/mLEGF+20～30ng/mLLIF+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素。3.根据权利要求1所述的类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的诱导培养的时间为20～24h。4.一种类角膜上皮细胞，其特征在于通过权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到。5.权利要求4所述的类角膜上皮细胞在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用。6.一种组织工程化角膜上皮，其特征在于由权利要求5所述的类角膜上皮细胞构建得到。7.权利要求6所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，其特征在于包含如下步骤：将上...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨学义，郭燕杰，马西亚，张沛，
申请(专利权)人：洛阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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