一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途，所述培养基包含基础培养基和小分子的组合，所维持的小分子的组合为CBF。其中C为CHIR‑99021,B为Blebbistatin，C为Forskolin。本发明专利技术在基础培养基中添加小分子CHIR，Blebbistatin，Forskolin，从而取代添加生长因子，在体外能够长期培养肝脏胆管的类器官，并可进一步诱导分化形成肝实质细胞。本方法有利于肝脏类器官在体外的大量扩增，并为肝脏相关疾病的研究及治疗提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，更具体地，本专利技术涉及培养基、CHIR-99021、blebbistatin以及forskolin在制备培养基中的用途、培养肝脏类器官的方法。
技术介绍
肝脏是机体的重要代谢器官，肝脏受损后会快速启动修复再生，而它的修复再生主要是由肝脏胆管细胞驱动的。近几年肝脏胆管的体外培养系统的推动了对肝脏领域的研究，在体外直接对肝脏胆管进行有效的实验和观察。体外培养的肝脏类器官可移植至受损肝脏并修复受损肝脏，除此之外体外培养的肝脏类器官还用于对病人个体的个性化药物筛选，肝脏的类器官培养在药物筛选和再生医学领域有巨大的应用价值。在进行小鼠肝脏类器官培养时，使用的培养条件为：基础培养基AdvancedDMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine和10mM的Nicotinamide,以及培养所需的生长因子：50ng/mL的EGF、25ng/mL的Noggin、500ng/mL的R-spondin1、100ng/mL的FGF10、50ng/mL的HGF以及10nM的[Leu15]-GastrinI。进行人的肝脏类器官养时需要在小鼠肝脏类器官培养基的基础上加入10uM的forskolin，5uM的A83-01。目前肝脏类器官培养需要加入EGF、Noggin、R-spondin、FGF10、HGF和[Leu15]-GastrinI等生长因子，这些生长因子价格昂贵，不利于肝脏类器官培养系统的应用，极大的限制的肝脏类器官在体外的大量扩增，用于肝脏医学领域的治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途。本专利技术提出的一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N-乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、CHIR-99021、blebbistatin和forskolin，其中：所述CHIR-99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM。本专利技术中，所述全小分子培养基还包括SUN11602、FH1和A83-01。本专利技术中，所述基础培养基为AdvancedDMEM/F12，所述血清替代物为N2或B27中一种或两种，所述双抗为青霉素或链霉素中任一种或两种，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2mM，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mM，所述Nicotinamide的浓度为10mM。本专利技术中，所述SUN11602的浓度为10μM，所述FH1的浓度为10μM，所述A83-01的浓度为0.5μM。本专利技术提出的一种的用于肝脏类器官培养的全小分子培养基的用途，所述全小分子培养基用于下列的至少之一：（１）培养肝脏类器官，其中：所述肝脏类器官为肝脏胆管细胞；（２）促进肝脏类器官增殖和/或分化，其中：所述小鼠肠隐窝或人肠肝脏胆管中任一种。本专利技术中，将包裹在基质胶中的肠隐窝在权利要求１-４任一项所述全小分子培养基中进行培养，所述肝脏类器官为肝脏胆管细胞。本专利技术中，所述培养是在无菌、5％CO2和37℃的条件下进行。本专利技术中，所述肝脏胆管细胞在权利要求1～４中任一项所述的全小分子培养基中进行培养或从肝脏胆管分离获得。本专利技术中，所述人肠肝脏胆管为肝脏胆管细胞上皮细胞，将肝脏胆管细胞上皮细胞在权利要求１-４任一项所述全小分子培养基中进行培养，本专利技术中，所述培养是在无菌、5％CO2和37℃的条件下进行。本专利技术中，所述CHIR-99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM，进行肝脏类器官的体外培养，促进肝脏类器官在体外的增殖。本专利技术中，所述培养基进一步包括SUN11602，所述浓度为10μM，FH1，所述浓度为10μM，进一步的稳定肝脏类器官在体外的增殖。本专利技术中，所述培养基进一步包括A83-01，浓度500μM，可以使培养的肝脏类器官更偏向于肝实质细胞。本专利技术中，所述基础培养基为AdvancedDMEM/F12，任选地，所述血清替代物为N2和B27，任选地，所述双抗为青霉素和链霉素，任选地，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2mM，任选地，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mM，任选地。本专利技术提供了一种肝脏类器官进一步分化为肝脏成熟实质细胞的方法。在本专利技术不含生长因子的，包含CHIR-99021、blebbistatin和forskolin培养基中培养一段时间的肝脏类器官，可进一步加入小分子DATP，A83-01培养4天，进一步在原有培养基小分子基础上添加地塞米松，培养2天，使得培养的肝脏胆管类器官进一步分化成为成熟的肝实质细胞。这一过程可在体外探究肝成熟分化的分子机制，为肝脏发育，代谢的研究与治疗提供平台。本专利技术中，利用本专利技术CHIR-99021、blebbistatin和forskolin培养基进行肝脏胆管类器官的体外培养。本专利技术中，所述DATP浓度为10μM，所述A83-01浓度为50nM，所述地塞米松的浓度为3μM，进一步使肝脏胆管类器官分化为成熟的肝实质细胞。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方法成本低，是一种不含生长因子的肝脏类器官培养，根据本专利技术实施例的培养基可以用于肝脏胆管细胞的培养，并可以长时间维持肝脏类器官在体外的培养。根据本专利技术实施例的培养基有利于降低培养成本，推动培养肝脏类器官的应用，为肝脏疾病的研究及治疗提供基础。附图说明图1是根据本专利技术实施例的CBF系统可以在体外维持小鼠肝脏类器官培养的结果图；其中：(ａ)CBF系统，(ｂ)GF组；图2是根据本专利技术实施例的CBF系统培养肝脏类器官与GF组培养肝脏类器官RT-qPCR的结果图；其中：(ａ)CBF系统，(ｂ)GF组；图3是根据本专利技术实施例的CBF系统培养的肝脏类器官可进一步分化的RT-qPCR结果图；图4是根据本专利技术实施例的CBF系统可以长时间培养的小鼠肝脏类器官的结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，参考附图描述的实施例是示例性的，用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。在以下实施例中，包含基础培养基AdvancedDMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine、10mM的Nicotinamide、3μM的CHIR-99021、10μM的blebbistatin以及3μMforskolin的培养基称为CBF培养基。现有的肝脏胆管类器官培养为基础培养基AdvancedDMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine和10mM的Nicotinamide,以及培养所需的生长因子：50ng/mL的EGF、25ng/mL的Noggin、500ng/mL的R-spondin1、100ng/mL的FGF10、50ng/mL的HGF以及10nM的[Leu15]-GastrinI，简称为GF培养基。实施例１：基于CBF培养基的肝脏类器官的培养按照本专利技术提供的CBF培养基在培养肝脏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，其特征在于：包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N‑乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、CHIR‑99021、blebbistatin和forskolin，其中：所述CHIR‑99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM。

【技术特征摘要】
1.一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，其特征在于：包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N-乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、CHIR-99021、blebbistatin和forskolin，其中：所述CHIR-99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM。2.根据权利要求1所述的全小分子培养基，其特征在于：所述全小分子培养基还包括SUN11602、FH1和A83-01。3.根据权利要求1所述的全小分子培养基，其特征在于：所述基础培养基为AdvancedDMEM/F12，所述血清替代物为N2或B27中一种或两种，所述双抗为青霉素或链霉素中任一种或两种，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2mM，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mM，所述Nicotinamide的浓度为10mM。4.根据权利要求２所述的全小分子培养基，其特征在于：所述SUN11602的浓度为10μM，所述FH1的浓度为10μM，所述A83-01...

【专利技术属性】
技术研发人员：林鑫华，赵冰，王鑫，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31