一种QX型IBV的细胞适应株MJ及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种QX型IBV的细胞适应株MJ及其应用，属于鸡传染性支气管炎病毒技术领域。所述细胞适应株MJ的保藏编号为CGMCC No.14681。试验表明，所述Vero细胞适应株MJ接种单层Vero细胞后收获细胞毒液的TCID50达到10

A cell-adapted strain MJ of QX-type IBV and its application

The invention provides a cell-adapted strain MJ of QX IBV and its application, belonging to the technical field of chicken infectious bronchitis virus. The preservation number of the cell-adapted strain MJ is CGMCC No. 14681. The results showed that the TCID50 of the cytotoxic solution of the Vero cell-adapted strain MJ reached 10 after inoculation with single Vero cell layer.

【技术实现步骤摘要】
一种QX型IBV的细胞适应株MJ及其应用
本专利技术涉及鸡传染性支气管炎病毒
，具体涉及一种QX型IBV的细胞适应株MJ及其应用。
技术介绍
鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)，为国际兽医局规定的家禽二类传染病之一，是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，对养鸡业造成严重的经济损失，严重制约着中国养禽业乃至国民经济的发展。根据IBV分离株的主要免疫保护基因(S1基因)序列，通过遗传进化分析确定毒株的基因型。研究表明，目前在中国鸡群中流行的IBV以QX基因型为代表的毒株为主，而经典的H120疫苗株等商品化疫苗已不能完全控制其流行，往往造成免疫失败，研制安全、高效的新型疫苗成为国内外发展的必然趋势。IBV的宿主范围窄，较难适应细胞培养，病毒主要使用鸡胚培养制备。国内鸡传染性支气管炎疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”工艺，它的缺点是鸡胚用量大，劳动强度大，去除杂蛋白的工艺复杂。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括Vero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，新的疫苗生产工艺不仅可以批量生产疫苗，提高产能，而且可以控制到只包含几种无害物质，从而显著提高抗原的纯净度，成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。因此建立鸡传染性支气管炎病毒的传代细胞培养技术就显得尤为关键。申请号为CN201310196897.5的中国专利技术专利公开了一种适于细胞培养的嵌合IBVH120S1基因膜外区的重组病毒及其构建方法和应用，申请号为CN201310573277.9的中国专利技术专利公开了一种嵌合IBV4/91株纤突蛋白膜外区基因片段的重组传染性支气管炎病毒及其构建方法和应用，以及申请号为201610502330.X的专利技术公开了一种基于反向遗传技术构建禽传染性支气管炎病毒(IBV)H120反向遗传株R-H120。它们的共同之处均是以IBV的Vero细胞适应株Beaudette毒株为基础，借助反向遗传技术构建适应细胞培养的重组病毒株。Beaudette毒株分离自20世纪的英国，是目前国内外公开报道的唯一一株能在Vero细胞上培养的毒株，其主要作为研究用的标准毒株而被国内外科研人员广泛使用。该毒株与国内目前流行的QX型IBV毒株差异较大，属于不同的基因型。由于Beaudette毒株Vero细胞适应株的传代次数较多，其本身的免疫原性基本丧失，不能作为疫苗株使用，但可以借助反向遗传操作技术，通过替换其中的主要免疫原性基因S1来构建具有免疫原性的重组疫苗株。通过这种途径获得的细胞适应株非天然毒株，在生物安全上存在隐患。因此，国内外缺少能在Vero细胞上培养的IBV，特别是缺少针对国内主要流行的QX型毒株的Vero细胞适应株。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术为了解决缺少一种能够适宜Vero细胞培养、安全的QX型IBV毒株，提供了一种Vero细胞适应株MJ，可在Vero细胞中快速增殖的QX型鸡传染性支气管炎病毒Vero细胞适应株，能替代鸡胚快速生产鸡传染性支气管炎病毒，其对SPF雏鸡无致病性，安全可靠。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种QX型IBV的Vero细胞适应株MJ，保藏编号为CGMCCNo.14681。优选的，所述Vero细胞适应株MJ的全基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了上述技术方案所述QX型IBV的Vero细胞适应株MJ在制备QX型IBV病毒中的应用。优选的，所述Vero细胞适应株MJ接种在Vero细胞上培养，培养液分离得到QX型IBV病毒。本专利技术还提供了前述技术方案所述QX型IBV的Vero细胞适应株MJ在制备鸡传染性支气管炎疫苗中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：一种QX型IBV的Vero细胞适应株MJ，保藏编号为CGMCCNo.14681。本专利技术通过TCID50、病毒生长曲线、对1日龄SPF雏鸡的致病力试验和毒力返强试验等测定MJ株的细胞培养特性及其致病性；通过接种SPF雏鸡和攻毒保护试验来测定MJ株的免疫原性。试验结果表明，所述Vero细胞适应株MJ，接种单层Vero细胞后收获的细胞毒液，其TCID50达到106.5/mL以上；MJ株对SPF雏鸡不具有致病性，病毒在鸡体内连续传代5个代次以上，病毒的毒力没有返强；采用MJ株接种Vero细胞后收获的细胞毒免疫SPF雏鸡后，机体的特异性抗体水平升高，对同型强毒的攻击提供良好的保护。利用本专利技术所述Vero细胞适应株MJ可大量制备得到QX型鸡传染性支气管炎病毒，适宜大规模工业化生产；同时，本专利技术所述Vero细胞适应株MJ对SPF雏鸡无致病性，生物安全性高，可应用于QX型鸡传染性支气管炎疫苗的制备。生物材料保藏信息QX型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的细胞适应株MJ，于2017年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCCNo.14681，分类命名为传染性支气管炎病毒，拉丁文名称为InfectiousBronchitisVirus。IBYZ分离株于2017年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCCNo.14682，分类命名为传染性支气管炎病毒，拉丁文名称为InfectiousBronchitisVirus。附图说明图1为本专利技术实施例1中MJ株亲本毒株IBYZ分离株的动物回归试验结果，其中A为正常肾脏，B为IBYZ分离株感染鸡后引起肾脏的典型病变；图2为本专利技术实施例2中MJ株接种单层Vero细胞后24h、48h以及72h观察到的细胞病变情况；图3为本专利技术实施例2中MJ株接种单层Vero细胞后间接免疫荧光检测结果，同时以其亲本毒株IBYZ作为对照；图4为本专利技术实施例2中MJ株接种单层Vero细胞后的生长曲线；图5为本专利技术实施例2中MJ株全基因组分段RT-PCR扩增产物的电泳检测结果；其中泳道M为标准分子量MarkerDL5000，1～18依次表示基因组分段扩增产物M1～M18；图6为本专利技术实施例3中MJ株对SPF雏鸡气管和肾脏组织的安全性检测时病理切片结果，同时设立PBS和IBYZ分离株最为对照；图7为本专利技术实施例4中MJ株的免疫原性检测结果，同时设立PBS、H120和IBYZ作为对照；图中每个时间段内的柱状图依次表示H120、IBY2、MJ以及PBS组；图8为本专利技术实施例4中MJ株的攻毒保护试验结果，同时设立PBS和H120作为对照。具体实施方式本专利技术提供了一种QX型IBV的Vero细胞适应株MJ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14681。优选的，本专利技术所述Vero细胞适应株MJ的全基因组序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述Vero细胞适应株MJ是以IBYZ分离株为母本毒株培养并分离得到的，所述IBYZ分离株的保藏编号为CGMCCNo.14682。具体来说，IBYZ分离株是本专利技术的专利技术人在2011年从某鸡场发病鸡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种QX型IBV的Vero细胞适应株MJ，保藏编号为CGMCC No.14681。

【技术特征摘要】
1.一种QX型IBV的Vero细胞适应株MJ，保藏编号为CGMCCNo.14681。2.根据权利要求1所述的Vero细胞适应株MJ，其特征在于，所述Vero细胞适应株MJ的全基因序列如SEQIDNO.1所示。3.权利要求1或2所述QX型IBV的Vero细胞适...

【专利技术属性】
技术研发人员：周生，唐梦君，俞燕，姜逸，程旭，高明燕，赵秀美，戴有理，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32