小分子诱导人成纤维细胞直接重编程为肝细胞的方法技术

本发明专利技术涉及小分子诱导人成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的方法。揭示了一种基于化学诱导细胞直接重编程机理，诱导人成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的方法及其小分子组合物，该小分子组合物可研发制备为治疗肝病的药物或药物前体。本发明专利技术还公开了该小分子组合物制备的细胞转分化培养基和试剂。

Direct reprogramming of human fibroblasts into hepatocytes induced by small molecules

The present invention relates to a method for direct reprogramming (transdifferentiation) of human fibroblasts into hepatocytes induced by small molecules. A method for inducing human fibroblasts to reprogram (transdifferentiate) into hepatocytes based on the mechanism of chemical induced cell direct reprogramming and its small molecule compositions are revealed. The small molecule compositions can be developed and prepared as drugs or drug precursors for the treatment of liver diseases. The invention also discloses a cell transdifferentiation medium and reagent prepared by the small molecule composition.

【技术实现步骤摘要】
小分子诱导人成纤维细胞直接重编程为肝细胞的方法
本专利技术属于细胞生物学、干细胞生物学(细胞重编程)、医学、药学交叉领域；更具体地，本专利技术涉及小分子诱导人成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的方法。
技术介绍
中国是肝病大国，甲肝、乙肝、脂肪肝、酒精肝、肝硬化(肝纤维化)等患病人数众多，而其中由各种肝病、化学药物、创伤等多种原因导致的急慢性肝衰竭，病情危重，病死率高。肝移植是治疗终末期肝病或肝功能衰竭的有效手段，然而肝源的缺乏使很多患者，尤其是急性肝衰竭患者失去治疗机会。肝细胞移植、生物人工肝和源于生物工程技术的全肝移植是肝移植的重要替代手段而被日渐关注并被广泛研究，如何获得足够数量的可用于临床治疗的人肝细胞来源就成为国际研究热点。目前，获得功能肝细胞的途径主要有以下方式：1)从供肝分离原代肝细胞；2)由干细胞或诱导多能干细胞等定向分化为肝细胞；3)由成纤维细胞等体细胞转分化为肝细胞等。从供肝分离原代肝细胞因为肝源的严重缺乏使其应用受限。干细胞定向诱导分化获得功能肝细胞，因为干细胞的无限增殖潜能而成为最可能获得足够数量肝细胞的有效手段和途径。然而现有的定向分化方法存在以下一个或者多个缺陷：如分化效率低、转化纯度低、分化获得的肝细胞功能欠缺、可能产生免疫排斥反应、存在干性细胞分化不彻底而有潜在致癌风险以及成本高昂等，不能满足临床的需求。而将成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，因为避免了重编程为iPS(Inducedpluripotentstemcell)细胞及其应用的潜在风险而受到关注。但目前已有的转分化为肝细胞方法采用的是导入外源基因的方式，存在致癌风险，这使其仍然很难临床应用；或者使用小分子将胃上皮细胞多能重编程为内胚层干细胞，然后定向分化为肝细胞、胰岛细胞、小肠上皮细胞等等。多能重编程应用于体内原位重编程存在较大困难和致癌风险；而且体内多能干细胞的定向分化具有较大困难和风险，因此难以实现成药性及临床应用；其体外应用也存在操作复杂，实验环节增加，质量难以控制，成本增加，临床应用风险增加等等缺陷。因此，如何避免导入外源诱导因子，仅用化学小分子将成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞，并克服上述定向分化或转分化肝细胞方法的缺陷，是肝细胞临床应用亟待解决的瓶颈问题。细胞重编程(Cellreprogramming)是细胞从一种类型向另外一种类型的转换，是通过调控细胞信号通路及表观遗传修饰的变化来改变细胞命运的过程。所谓表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。细胞重编程可通过核移植(Nucleartransfer，NT)、胞质孵育、细胞融合、以及转录因子或化学因子诱导细胞重编程等方式实现。其中诱导细胞重编程是目前公认的突破性研究领域(注：本方法所指细胞重编程即为转录因子或化学因子诱导的细胞重编程)。诱导细胞重编程包括：(1)分化的细胞逆转恢复到多能或全能性状态的多能性重编程；(2)不经过多能干细胞阶段，从一种分化细胞类型直接转化为另一种分化细胞类型的直接重编程(转分化/谱系重编程)。仅用化学小分子诱导的细胞重编程又称为化学诱导细胞重编程。化学小分子的使用被认为是改善细胞重编程过程的一种最有前途的方法，不但可以替代并减少转录因子的使用，甚至可以完全替代转录因子实现细胞重编程。化学诱导细胞重编程消除了通过外源基因导入的细胞重编程方法的许多弊端，对细胞更有亲和力，更少突变的发生，达到了简化操作、减少致癌风险、缩短重编程周期、提高重编程效率的目的。尤其从应用的角度考虑，对于今后将直接重编程(以下简称：转分化)因子成药化,或体内原位将细胞转分化都是至关重要的。如心肌、大脑、肝脏等重要器官发生损伤或病变时，将成纤维细胞甚至病变细胞原位转分化为相应的正常分化功能细胞从而治愈损伤或疾病。化学诱导细胞重编程领域近年来不断获得突破性研究进展，不仅可以将成纤维细胞转化为iPS细胞，还可以将成纤维细胞转分化为神经细胞和心肌细胞等。然而，仅使用化学小分子将人成纤维细胞转分化为肝细胞则未见任何报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小分子组合物诱导人成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的方法及小分子组合物；该小分子组合物可添加药物载体或赋型剂研发制备成临床治疗肝纤维化，或慢性肝功能衰竭的药物或药物配方；或添加水性溶剂或有机溶剂、基础培养基或无血清培养基制备成科研用细胞转分化试剂或培养基；或用于将人成纤维细胞转分化为肝细胞，为医药应用及临床肝细胞移植治疗肝衰竭提供肝细胞源。在本专利技术的第一方面，提供一种用于化学诱导人成纤维细胞直接重编程(转分化)为肝细胞的小分子组合物(或配方)，所述的组合物包括GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂和G9a组蛋白甲基转移酶(G9aHMTase)抑制剂；或所述的组合物由GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、G9aHMTase抑制剂组成。在一个优选例中，所述的组合物包括：GSK3β抑制剂：5-80重量份；TGFβ抑制剂：0.1-50重量份；和G9aHMTase抑制剂：0.1-50重量份。在另一优选例中，所述的组合物可为溶液状态组合物，包括：GSK3β抑制剂：终浓度为：0.1-20uM；和TGFβ抑制剂：终浓度为：0.01-20uM；和G9aHMTase抑制剂：0.01-20uM。在另一优选例中，所述的组合物包括：GSK3β抑制剂：10-70重量份；和TGFβ抑制剂：0.5-40重量份；和G9aHMTase抑制剂：0.5-40重量份。在另一优选例中，所述的组合物可为溶液状态组合物，包括：GSK3β抑制剂：终浓度为：0.5-10uM；和TGFβ抑制剂：终浓度为：0.05-10uM；和G9aHMTase抑制剂：0.05-10uM。在另一优选例中，GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、G9aHMTase抑制剂相加的重量占组合物总重量的0.01～99.9％；更佳地为50～99.9％；溶液状态下为0.1～50％，如1％，5％，10％，20％，30％等。在另一优选例中，所述的组合物中，GSK3β抑制剂(如GSK3β抑制剂CHIR99021)，TGFβ抑制剂(如TGFβ抑制剂SB431542或/和A83-01)，G9aHMTase抑制剂(如BIX01294)，以重量份比：(5-80)﹕(0.1-50)﹕(0.1-50)；较佳地，(10-70)﹕(0.5-40)﹕(0.5-40)存在；或溶液状态下以摩尔浓度比：(0.1-20)﹕(0.01-20)﹕(0.01-20)；较佳地，(0.5-10)﹕(0.05-10)﹕(0.05-10)存在。上述重量份比的重量单位可以是：千克(kg)、毫克(mg)、微克(ug)等任一重量单位；摩尔浓度比的摩尔单位可以是：摩(M)、毫摩(mM)、微摩(uM)等任一摩尔浓度单位；且，所述的组合物应用于大动物和病人时，按小动物使用剂量通过相应的专业换算公式，换算出大动物或人的有效使用剂量(包括固态或溶液态的剂量换算)，也属于本专利技术的保护范围。在另一优选例中，所述的GSK3β抑制剂包括：CHIR-99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR-98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于化学诱导人成纤维细胞直接重编程为肝细胞的小分子组合物，其特征在于，所述的组合物包括GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂和G9aHMTase抑制剂；或所述的组合物由GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、G9aHMTase抑制剂组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于化学诱导人成纤维细胞直接重编程为肝细胞的小分子组合物，其特征在于，所述的组合物包括GSK3β抑制剂，TGFβ抑制剂和G9aHMTase抑制剂；或所述的组合物由GSK3β抑制剂、TGFβ抑制剂、G9aHMTase抑制剂组成。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：GSK3β抑制剂：5-80重量份；或溶液状态下终浓度为：0.1-20uM；TGFβ抑制剂：0.1-50重量份；或溶液状态下终浓度为：0.01-20uM；和G9aHMTase抑制剂：0.1-50重量份；或溶液状态下终浓度为：0.01-20uM。3.如权利要求1-2所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：GSK3β抑制剂：10-70重量份；或溶液状态下终浓度为：0.5-10uM；TGFβ抑制剂：0.5-40重量份；或溶液状态下终浓度为：0.05-10uM；和G9aHMTase抑制剂：0.5-40重量份；或溶液状态下终浓度为：0.05-10uM。4.如权利要求1-3任一所述的组合物，其特征在于，所述的GSK3β抑制剂包括但不限于：CHIR-99021、BIO、IM-12、TWS119、1-Azakenpaullone、CHIR-98014、Tideglusib、AR-A014418、LY2090314、SB216763、AZD1080等为代表的，具相同功能，或诱导相同靶点的同一类GSK3β信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为GSK3β抑制剂CHIR-99021、BIO或TWS119；所述的TGFβ抑制剂包括但不限于：SB431542、A83-01、SB525334、LY2109761，RepSox、SD-208、GW788388、SB505124、EW-7197，Galunisertib等为代表的，具相同功能，或诱导相同靶点的同一类TGFβ信号通路抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为TGFβ抑制剂SB431542、A83-01或LY2109761；所述的G9aHMTase抑制剂，包括但不限于：BIX01294、UNC0638、A-366、UNC0631、BRD4770、UNC0224、UNC0646、UNC0642等为代表的，具相同功能，或诱导相同靶点的同一类G9aHMTase抑制剂或化合物，或与它们等效的药剂制品、类似物、异构体和/或其盐、水合物或前体，或其组合；较佳地为G9aHMTase抑制剂BI...

【专利技术属性】
技术研发人员：张培霖，
申请(专利权)人：海门雨霖细胞科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32