一种体外呼吸暴露模型构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种体外呼吸暴露模型构建方法，其包括如下步骤：将呼吸道上皮细胞接种至共培养系统上的带孔膜材上，培养至细胞贴壁，所述膜材将培养系统分割成上室和下室两个区域；向共培养系统下室加入细胞培养基，向上室中加入肺表面活性剂，继续培养0.5～12小时；向上室中添加毒性物质或药物进行暴露，然后对呼吸道上皮细胞进行毒理学指标评价。以及，提供上述体外呼吸暴露模型构建方法在的环境污染物或药物评价中的应用。

Construction and application of an in vitro respiratory exposure model

The invention provides a method for constructing an in vitro respiratory exposure model, which comprises the following steps: inoculating respiratory epithelial cells onto a porous membrane on a co-culture system and culturing them to adhere to the cell wall; the membrane divides the culture system into two regions: the upper and lower chambers; adding cell culture medium to the lower chamber of the co-culture system, adding pulmonary surfactant to the upper chamber, and continuing to cultivate 0.5 cells. To 12 hours, toxic substances or drugs were added to the room for exposure, and then toxicological indexes of respiratory epithelial cells were evaluated. And, to provide the application of the above-mentioned in vitro respiratory exposure model construction method in environmental pollutants or drug evaluation.

【技术实现步骤摘要】
一种体外呼吸暴露模型构建方法和应用
本专利技术属于生物医学工程
，具体涉及一种体外呼吸暴露模型构建方法和应用。
技术介绍
呼吸系统是人体与外界环境进行气体交换的器官系统，包括气体的通道鼻、咽喉、气管、支气管以及气体交换器官肺。由于呼吸系统特殊的结构和功能，一些气态污染物或颗粒物能够通过鼻或口等呼吸途径进入人体，从而危害人体健康。此外，一些肺部疾病，比如哮喘、慢性阻塞性肺病等，在治疗过程中也可以通过呼吸道进行给药。污染物或者药物进入呼吸道后，会对呼吸道的上皮细胞造成一定的影响，从而进一步影响肺的功能。以往毒理学研究呼吸暴露的体外模型，往往采用细胞培养的方法，直接将有毒有害物质或者治疗药物添加至培养基中进行细胞毒性评价。但是这种暴露模型并不能很好的模拟肺部的真实环境。毒性物质或者药物直接添加到培养基中评价细胞毒性的方法不能很好模拟肺部的真实环境，忽略了真实肺部微环境对毒性物质或者药物的影响。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种体外呼吸暴露模型构建方法和应用。本专利技术提供一种体外呼吸暴露模型构建方法，其包括如下步骤：将呼吸道上皮细胞接种至共培养系统上的带孔膜材上，培养至细胞贴壁，所述膜材将培养系统分割成上室和下室两个区域；向共培养系统下室加入细胞培养基，向上室中加入肺表面活性剂，继续培养0.5～12小时；向上室中添加毒性物质或药物进行暴露，然后对呼吸道上皮细胞进行毒理学指标评价。以及，提供上述体外呼吸暴露模型构建方法在环境污染物或药物评价中的应用。本专利技术提供的一种体外呼吸暴露模型构建方法，由呼吸道上皮细胞一侧暴露于肺表面活性剂环境中，另一侧利用细胞培养基供给营养，利用共培养系统实现模拟真实环境下肺部上皮细胞暴露的液体环境。与以往的技术手段相比，本专利技术能够更加真实模拟毒性物质或者药物的呼吸暴露情况，这是因为人体中的呼吸道浸润在一定的液体环境中，特别是呼吸道终末的肺泡浸润在肺表面活性剂中，维持自身表面张力平衡，防止呼吸气末肺塌陷。肺表面活性剂是一种组分复杂的混合物，主要由II型肺泡上皮细胞合成和分泌，含有70-80％的磷脂、10％的蛋白质和10％的中性磷脂。有害物质特别是超细颗粒物以及呼吸道给药的药物最终在呼吸道的终末段与肺表面活性剂联合作用影响肺的功能。因此，该方法能够为环境污染评价提供科学指导。附图说明图1是本专利技术构建的体外呼吸暴露模型的示意图。图2是本专利技术实施例2和对比例1碳黑颗粒物的细胞毒性的对比图。图3是本专利技术实施例3构建的体外呼吸暴露模型检测柴油机尾气颗粒物的细胞毒性图。图4是本专利技术实施例4构建的体外呼吸暴露模型检测大气污染颗粒物的细胞毒性图。图5是本专利技术实施例5构建的体外呼吸暴露模型检测沙丁胺醇药物的细胞毒性图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种体外呼吸暴露模型构建方法，其包括如下步骤：S01：将呼吸道上皮细胞接种至共培养系统上的带孔膜材上，培养至细胞贴壁，所述膜材将培养系统分割成上室和下室两个区域；S02：向共培养系统下室加入细胞培养基，向上室中加入肺表面活性剂，继续培养0.5～12小时；S03：向上室中添加毒性物质或药物进行暴露，然后对呼吸道上皮细胞进行毒理学指标评价。步骤S01中，具体地，所述共培养系统为如图1所示的共培养系统，上室和下室两个区域被带孔膜材隔开，细胞培养在带孔膜材上。更具体地，所述共培养系统为transwell共培养系统，所述带孔膜材的材质为聚碳酯、聚酯或者胶原包被的聚四氟乙烯。更优选地，所述带孔膜材的材质为胶原包被的聚四氟乙烯，由于后续需要上室加入肺表面活性剂，因此将上皮细胞接种至胶原包被的聚四氟乙烯上，细胞更容易贴壁，且上室中的肺表面活性剂对在该种膜材上的细胞影响更小。同时，肺表面活性剂浸润时，作为带孔膜材的胶原包被的聚四氟乙烯时透明的，方便观察拍照。优选地，所述带孔膜材的孔径范围为0.1-3.0微米，例如可以是0.1微米、0.2微米、0.4微米、0.8微米、1.2微米、1.6微米、2.0微米、2.4微米、2.8微米或3.0微米，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步，优选为0.1-0.4微米。优选地，所述呼吸道上皮细胞在带孔膜材上的密度为4×104～4×105个细胞/cm2，例如可以是1×105个细胞/cm2、2×105个细胞/cm2、3×105个细胞/cm2、以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。进一步，所述呼吸道上皮细胞在带孔膜材上的密度为1×105～2×105个细胞/cm2。具体地，所述呼吸道上皮细胞为支气管上皮细胞或肺泡上皮细胞；更具体地，将呼吸道上皮细胞进行体外培养，在细胞的对数生长期生长阶段，用胰酶消化液消化，接种至共培养系统上的带孔膜材上，放进细胞培养箱继续培养至贴壁，通常为12～36小时，所述胰酶消化液为0.25％胰酶和0.02％EDTA。步骤S02中，向共培养系统下室加入细胞培养基，所述细胞培养基为含有10％胎牛血清的细胞培养基，培养基充满下室，直至和细胞接触，所述细胞培养基为RPMI1640培养基、MEM培养基、DMEM培养基或者BEGM培养基中的任意一种。培养基如果通过带孔膜材进入到上室中，可以将液体小心吸净。再向共培养系统的上室中加入肺表面活性剂，继续培养0.5～12小时。所述肺表面活性剂为哺乳动物肺表面活性剂，优选为牛肺表面活性剂或猪肺表面活性剂。这两种肺表面活性剂比较容易获取，并且与人的肺表面活性剂的成分比较接近。肺表面活性剂加入量为呼吸道上皮细胞以上2-5毫米，肺表面活性剂过少细胞容易脱水，2-5毫米的高度既可以保持细胞的液体环境又接近真实肺部环境。步骤S03中，向上室中添加毒性物质或药物进行暴露，然后进行毒理学指标评价。所述毒性物质为微纳尺寸固体，所述毒性物质的添加是添加其胶体溶液或者悬浮物溶液。所述药物为沙丁胺醇、博利康尼等药物，添加方式优选以药物溶液的方式添加。本专利技术实施例还提供上述体外呼吸暴露模型构建方法在环境污染物或药物评价中的应用。该方法能够更加真实模拟现实暴露的体外呼吸暴露模型，在环境污染评价中具有重要的意义。以下结合具体实施例对本专利技术的具体实现进行详细描述。实施例1：将人肺上皮细胞Beas-2B进行体外培养，细胞生长至对数生长期后，除去培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗三次，然后用胰酶消化液进行消化，消化时间为3分钟。消化结束后，加入含有胎牛血清的MEM培养基进行终止，离心后加入新鲜的培养基重悬，按照5×104/cm2的细胞密度接种至3470型号的共培养系统上室的带孔膜材上，放进细胞培养箱继续培养24小时；向共培养模型下室加入500微升含有胎牛血清的MEM细胞培养基，将接种细胞的上室嵌套进下室中，将共培养系统上室中的液体小心吸净，然后向上室中添加100微升的牛肺表面活性剂，继续培养12小时；将雾霾颗粒溶于水中，加入到共培养系统的上室，24小时后，小心除掉肺表面活性剂；每孔加入110μL，含10％(体积比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外呼吸暴露模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将呼吸道上皮细胞接种至共培养系统上的带孔膜材上，培养至细胞贴壁，所述膜材将培养系统分割成上室和下室两个区域；向共培养系统下室加入细胞培养基，向上室中加入肺表面活性剂，继续培养0.5～12小时；向上室中添加毒性物质或药物进行暴露，然后对呼吸道上皮细胞进行毒理学指标评价。

【技术特征摘要】
1.一种体外呼吸暴露模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将呼吸道上皮细胞接种至共培养系统上的带孔膜材上，培养至细胞贴壁，所述膜材将培养系统分割成上室和下室两个区域；向共培养系统下室加入细胞培养基，向上室中加入肺表面活性剂，继续培养0.5～12小时；向上室中添加毒性物质或药物进行暴露，然后对呼吸道上皮细胞进行毒理学指标评价。2.如权利要求1所述的体外呼吸暴露模型构建方法，其特征在于，所述带孔膜材的材质为聚碳酯、聚酯和胶原包被的聚四氟乙烯中的至少一种。3.如权利要求2所述的体外呼吸暴露模型构建方法，其特征在于，所述带孔膜材的材质为胶原包被的聚四氟乙烯。4.如权利要求1所述的体外呼吸暴露模型构建方法，其特征在于，所述肺表面活性剂为哺乳动物肺表面活性剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐敬龙，王红梅，程文婷，尹慧敏，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37