一种田间油菜组织快速繁殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种田间油菜组织快速繁殖的方法，具体包括将甘蓝型油菜Polima CMS恢复系627R、621R、616R中的油菜花蕾剥除了花萼、花瓣后剩下的子房和花柄连接部位和油菜侧芽进行合适的培养，得到不定芽后再置于添加有矮壮素的培养基中进行培养，得到壮苗。本发明专利技术所述方法实用性强，大幅提高油菜组织的繁殖速度，再生频率高，且有利于不定芽的根系生长，得到强壮幼苗，建立和优化了恢复系油菜的快繁再生体系，可快速获得具有优良性状的油菜新种质。

【技术实现步骤摘要】
一种田间油菜组织快速繁殖的方法
本专利技术涉及农作物培养领域，特别涉及一种田间油菜组织快速繁殖的方法。
技术介绍
油菜属于十字花科芸薹属，是世界四大油料作物之一，也是我国重要的油料作物之一。油菜种子可以榨取食用油，饼粕可用作饲料，茎杆可以食用，同时油菜花具有观赏价值，大面积种植促进了城郊赏花经济发展。油菜是可再生资源，被认为是生物柴油最理想的原料。随着农业生物技术的发展，油菜组织培养快速繁殖的体系建立和改良对加速油菜育种新资源的创建具有重要意义。植物组织培养是指利用植物离体的器官、组织或者细胞，在适宜的人工培养和无菌条件下进行培养，使其增殖、生长、发育形成植株的方法。植物器官发生途径是指在组织培养中，再生植株不是通过胚胎，而是通过分生中心直接分化器官，最终形成完整植株的总过程。通常分为器官间接发生途径和器官直接发生途径。器官间接发生途径是指外植体先诱导产生愈伤组织，然后愈伤组织再诱导产生芽和根系，主要优点是繁殖系数高，在短时间能够形成大量的器官分化，产生大量小植株。但是随着愈伤组织继代时间的延长，表现出的植株再生能力会逐渐降低，甚至消失。器官直接发生途径是指外植体在培养基上直接诱导产生芽和根，优点是细胞染色体倍数稳定，发生变异的频率低，保证所培养的试管苗保持来源母株良好的种性。叶腋间的发芽、不定芽如茎尖、花托等都可以诱导产生不定芽。总体来看，油菜的再生频率相对较低，这可能与外植体类型、基因型有关，因此建立高效、重复性强的诱导再生体系是创建油菜新资源的应用重点之一[1-6]。经过多年研究，国内外许多研究单位已经建立了适用性的油菜离体再生体系，然而研究表明油菜不同基因型、不同外植体之间最佳离体再生的培养条件存在差异，阻碍了油菜组织培养快速繁殖研究的发展[8-10]。在油菜快速繁殖的体系中，应用较多的外植体有大田植株的花、侧芽、无菌苗的子叶、下胚轴以及根段等，这些外植体在再生体系中能够短期内获得大量的植株，不受到季节和地点等因素的限制[11-12]。甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)627R，621R，616R是高产优质杂交油菜新品种的核心恢复系。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种田间油菜组织快速繁殖的方法，所述方法建立了一个高效的恢复系油菜的快繁再生体系，可快速获得具有优良性状的油菜新种质。本专利技术的技术方案为：一种田间油菜组织快速繁殖的方法，具体包括以下步骤：1)选取生长至抽薹期油菜的侧芽或抽薹开花期油菜的未开放花蕾先用清水处理，在75％酒精表面消毒1-2min，0.1％升汞消毒10-20min，无菌水冲洗3-6次，用无菌滤纸吸干表面水分；2)将步骤1)消毒后的侧芽插入MA培养基中，或消毒后的未开放花蕾的花萼、花瓣剥除后，将子房和花柄连接部位插入MA培养基中培养20-30天得到不定芽；所述MA培养基为：在MS培养基中，添加有8-12mg/L6-BA、0.5-1mg/LNAA、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述MA培养基的PH值为5.8-5.9。还包括：3)将步骤2)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养25-30天；所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有10-15mg/LCCC、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.8-5.9。一种田间油菜组织快速繁殖的方法，具体包括以下步骤：1)选取生长至抽薹期油菜的侧芽或抽薹开花期油菜的未开放花蕾先用清水处理，在75％酒精表面消毒1min，0.1％升汞消毒15min，无菌水冲洗3-6次，用无菌滤纸吸干表面水分；2)将步骤1)消毒后的未开放花蕾的花萼、花瓣剥除后，将子房和花柄连接部位插入MA培养基中，或将消毒后的侧芽插入MA培养基中培养20-30天得到不定芽；所述MA培养基为：在MS培养基中，添加有10mg/L6-BA、1mg/LNAA、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述MA培养基的PH值为5.85。3)将步骤2)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养25-30天；所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有15mg/LCCC、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.85。所述油菜来源于甘蓝型油菜PolimaCMS恢复系627R、621R、616R中的一种或几种。本专利技术的技术效果为：本专利技术所述田间油菜组织快速繁殖的方法，涉及油菜抽薹期和抽薹开花期切取的组织的培养体系，以及添加有矮壮素的生根壮苗培养基的适用，形成了一个极其高效的培养系统，大幅提高油菜组织的出芽率，同时培养出的不定芽生根繁茂，幼苗生长壮实，所述方法加速油菜育种新资源的创建。附图说明图1为本专利技术中采取油菜的花蕾，用镊子剥除未开放花蕾的花萼、花瓣，将子房和花柄连接部位插入到MA培养基中培养效果图。图2为图1所示培养组织在MA培养基中生长30天后子房基部逐渐膨大分化愈伤组织示意图；图2中箭头所指为子房。图3为愈伤组织脱分化成芽示意图；图3中有尾箭头所指为愈伤组织，无尾箭头所指子房。图4为将田间油菜腋芽消毒处理后置于MA培养基中培养30天，从腋芽基部分化出愈伤组织效果图。图5为愈伤组织脱分化生长出芽，进一步生长成苗效果图；图5中箭头所指为愈伤组织。具体实施方式为更好理解本专利技术，下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步地详细说明，但是本专利技术要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。1.材料与方法1.1实验材料以甘蓝型油菜杂交品种恢复系627R，621R和616R材料田间种植植株为外植体。1.2实验方法1.2.1无菌外植体获得对于种植在田间生长到抽薹期或者开花期的材料，选取侧芽和未开放的无病虫害花蕾(长度4-6mm，柱头不外露)。先用清水处理，在75％酒精表面消毒1min，0.1％升汞消毒15min，无菌水冲洗3-6次，用无菌滤纸吸干油菜组织表面水分，用镊子剥除未开放花蕾的花萼、花瓣，将子房和花柄连接部位插入到MA培养基(MS+10mg/L6-BA+1mg/LNAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH5.85)培养，同样将消毒处理的侧芽直接插入到MA培养基中培养20-30天。1.2.2不同浓度的矮壮素处理对不同油菜恢复系成苗后生物量积累的影响对三个不同材料分化出的芽转移到含有不同浓度(0mg/L，5mg/L,10mg/L,15mg/L)矮壮素(CCC)的MS培养基中，生长30天后统计不同处理下植株的平均根长，根鲜重和植株鲜重。1.2.3实验数据分析试验数据均采用SPSS软件分析，差异显著性采用Duncan新复极差法进行多重比较。分化频率(％)＝再生不定芽总数/接种外植体总数×100％2.结果与分析将生长在田间抽薹开花期油菜的花蕾和腋芽按照上述处理的方法，直接转移到MA培养基(MS+10mg/L6-BA+1mg/LNAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，PH5.85)培养30天，子房基部或者腋芽和分化培养基MA接触部分会逐渐膨大，形成结构致密的黄色愈伤组织，随着培养时间的延长，从愈伤组织的细胞团长出若干个芽，将芽切取转移到生根培养基上1周后统计出苗情况。结果显示，接种三个油菜材料的腋芽的苗再生频率极显著高于子房培养后得到的苗再生频率(表1)。表1田间种植不同材料的腋芽和花托在MA培养基上再生频率将三个恢复本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种田间油菜组织快速繁殖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)选取生长至抽薹期油菜的侧芽或抽薹开花期油菜的未开放花蕾先用清水处理，在75％酒精表面消毒1‑2min，0.1％升汞消毒10‑20min，无菌水冲洗3‑6次，用无菌滤纸吸干表面水分；2)将步骤1)消毒后的侧芽插入MA培养基中，或消毒后的未开放花蕾的花萼、花瓣剥除后，将子房和花柄连接部位插入MA培养基中培养20‑30天得到不定芽；所述MA培养基为：在MS培养基中，添加有8‑12mg/L 6‑BA、0.5‑1mg/L NAA、25‑35g/L蔗糖、6‑10g/L琼脂；所述MA培养基的PH值为5.8‑5.9。

【技术特征摘要】
1.一种田间油菜组织快速繁殖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)选取生长至抽薹期油菜的侧芽或抽薹开花期油菜的未开放花蕾先用清水处理，在75％酒精表面消毒1-2min，0.1％升汞消毒10-20min，无菌水冲洗3-6次，用无菌滤纸吸干表面水分；2)将步骤1)消毒后的侧芽插入MA培养基中，或消毒后的未开放花蕾的花萼、花瓣剥除后，将子房和花柄连接部位插入MA培养基中培养20-30天得到不定芽；所述MA培养基为：在MS培养基中，添加有8-12mg/L6-BA、0.5-1mg/LNAA、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂；所述MA培养基的PH值为5.8-5.9。2.根据权利要求1所述的田间油菜组织快速繁殖的方法，其特征在于，还包括：3)将步骤2)得到的不定芽转移到矮壮素生根培养基中，培养25-30天；所述矮壮素生根培养基为：在MS培养基中，添加有10-15mg/LCCC、25-35g/L蔗糖、6-10g/L琼脂，所述矮壮素生根培养基的PH值为5.8-5.9。3.根据权利要求2所述的田...

【专利技术属性】
技术研发人员：万丽丽，王转茸，谭庆，孙玉宏，辛强，洪登峰，杨光圣，
申请(专利权)人：武汉市农业科学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42