一种柯萨奇病毒减毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种柯萨奇病毒减毒株及其应用，所述的柯萨奇病毒减毒株为柯萨奇病毒B组5型JZ‑P50株（Enterovirus coxsackie virus CVB5 JZ‑P50），保藏编号为CCTCC No：V201858。本发明专利技术利用减毒活疫苗的方式，对柯萨奇病毒B5毒株进行减毒，所用细胞为Vero细胞，通过低温连续培养50代，意外地获得CVB5减毒疫苗，与野生病毒株相比，具有冷适应性和温度敏感性的优势特征，具有体内减毒特性、免疫原性和遗传安全性的性能改进，为降低生产成本，制备有效的、安全的、廉价的CVB5疫苗提供了保障。

A attenuated coxsackievirus strain and its application

The present invention provides a attenuated Coxsackie virus strain and its application. The attenuated Coxsackie virus strain is JZ P50 strain of Coxsackie virus group B type 5 (Enterovirus Coxsackie virus CVB5 JZ P50), and its storage number is CCTCC No: V2018. The present invention uses live attenuated vaccine to attenuate coxsackievirus B5 strain. The cells used are Vero cells, which are continuously cultured at low temperature for 50 generations. The attenuated coxsackievirus B5 vaccine is accidentally obtained. Compared with the wild virus strain, the attenuated coxsackievirus B5 strain has the advantages of cold adaptability and temperature sensitivity, and has the characteristics of in vivo attenuation, immunogenicity and genetic safety, so as to reduce production. Cost, preparation of effective, safe and inexpensive CVB5 vaccine provides a guarantee.

【技术实现步骤摘要】
一种柯萨奇病毒减毒株及其应用
本专利技术涉及一种柯萨奇病毒减毒株及其应用，属于生物

技术介绍
柯萨奇病毒B组5型(CoxsakievirusB5，CVB5)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，肠道病毒属(Enterovirus)是一种常见的人类肠道病毒，感染后轻则可引起婴幼儿上呼吸道感染、腹泻及手足口病，重则能引起18岁以下人群病毒性脑膜炎，无菌性脑膜炎、胰腺炎、扩张性心肌病等多种疾病。CVB5在全世界范围内广泛流行，但对于引起的重症疾病目前并没有有效的治疗手段，更没有可预防的CVB5疫苗的报道。当前研究疫苗的方法有很多，比如，亚单位疫苗，活载体疫苗、核酸疫苗等，这些疫苗已不是完整的病原体，而是相关的蛋白(多肽、肽)、多糖和核酸，经过载体免疫接种后，诱导机体产生特异性的体液或细胞免疫反应，但是也会存在免疫原性较弱，无法达到保护效果，甚至会导致疾病的加重。传统的疫苗方法就显得安全有效很多。传统疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗是用物理、化学方法杀死病原微生物，但仍保持其免疫原性的一种疫苗，优点是没有毒力，安全性好，相对稳定，4℃可保存一年以上，缺点抗原用量多且接种次数多，只引起体液免疫，免疫维持时间短，在体内不增殖。减毒活疫苗通过毒力变异或人工选择法(温度敏感株)而获得减毒或无毒株，但仍保留其繁殖能力和免疫原性的一种疫苗，优点是抗原用量少接种一次即可，可诱发体液免疫和细胞免疫的双重功效，免疫维持时间较长，缺点有毒力返祖的危险，相对不稳定，不易保存。制备减毒活疫苗的方法也有多种，体内外传代减毒、低温培养筛选、诱变减毒等。目前我国已成功研制出的疫苗，脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、水痘疫苗、甲型肝炎疫苗和乙型脑炎疫苗都属于减毒活疫苗。现有技术中存在的技术问题是：缺少一种免疫原性和安全性都符合要求的柯萨奇病毒B组5型减毒活疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种柯萨奇病毒减毒株及其应用。本专利技术的目的是筛选出一株柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株(EnteroviruscoxsackievirusCVB5JZ-P50)，使其毒力降低且不丧失免疫原性。CVB5毒株是从云南省第一人民医院手足口病患儿的粪便中获得，通过连续低温传代而获得温度敏感株，命名为JZ-P50，该减毒株已于2018年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址中国武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCCNO：V201858；本专利技术的CVB5温度敏感株JZ-P50免疫动物后证明具有安全性和免疫原性，认为可作为减毒活疫苗的毒种。本专利技术涉及到的微生物的保藏信息如下：保藏日期：2018.10.23保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏编号：CCTCCNo：V201858；分类命名：柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株(EnteroviruscoxsackievirusCVB5JZ-P50)。特征：与野生病毒株相比，具有冷适应性和温度敏感性的特征优势，具有体内减毒特性、免疫原性和遗传安全性的性能。本专利技术还提供了上述的柯萨奇病毒减毒株在制备柯萨奇病毒B组5型减毒疫苗中的应用。本专利技术制备柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株减毒活疫苗的方法如下：(1)使用细胞生长液将Vero细胞(购自于ATCC)在37℃CO2培养箱下培养成致密的单层，细胞生长液为含有10％的胎牛血清的MEM培养基；(2)弃掉细胞上清液，换成含有2％胎牛血清的MEM维持液，以盲传的方式接种柯萨奇病毒B组5型毒株，在33℃培养箱培养，直至细胞出现70％-80％病变，收获病毒液作为下一代接种的毒种，连续培养50代，最终获取柯萨奇病毒B组5型温度敏感株JZ-P50。(3)收获病毒液采用本领域最常用的方法，将病变70％-80％的细胞反复冻融于-20℃2-3次，在超净台中收集病毒液，12000rpm，离心10min，获取上清即为病毒液，-20℃保存。(4)制备疫苗首先将病毒纯化，采用的方法是本领域中常规的蔗糖密度梯度离心法，将粗制的减毒病毒悬液12000rpm离心1h，获取上清液，将含病毒的上清液经蔗糖梯度(浓度范围：从底层开始2ml60％蔗糖；2ml45％蔗糖；2ml30％蔗糖；2ml15％蔗糖)，4℃40000rpm离心7h，之后将条带样品经分子截留量为50kd的透析袋进一步去除残余蔗糖离子等杂质，PEG8000浓缩，用磷酸盐缓冲液如PBS悬浮所得样品，并测病毒滴度，由此制得柯萨奇病毒减毒疫苗。本专利技术中的柯萨奇病毒B组5型原始毒株是从云南省第一人民医院手足口病患儿的粪便中分离获得能保证其有效的抗原；本专利技术中用于繁殖病毒的细胞基质为Vero细胞，是世界卫生组织(WHO)推荐为生产人用疫苗的理想细胞基质，与其他细胞基质相比，这些细胞基质作为人用疫苗细胞基质是安全可靠的。动物实验也已证明JZ-P50株具有良好的安全性和免疫原性。本专利技术的优势在于利用减毒活疫苗的方式，对柯萨奇病毒B5毒株进行减毒，所用细胞为Vero细胞，通过低温连续培养50代，意外地获得本专利技术的CVB5减毒病毒株，与野生病毒株相比，具有冷适应性和温度敏感性的优势特征，具有体内减毒特性、免疫原性和遗传安全性的性能改进，为降低生产成本，制备有效的、安全的、廉价的CVB5疫苗提供了保障。附图说明图1为正常的Vero细胞电镜示意图；图2为接种柯萨奇病毒B组5型毒株的Vero细胞病变示意图；图3为CVB5毒株不同代次33℃和37℃下的滴度变化情况；图4为CVB5毒株不同代次33℃/37℃比值情况；图5为幼鼠接种106TCID50平均体重变化；图6为幼鼠5日龄体表特征变化；图7为接种剂量106TCID50幼鼠存活情况；图8为5日龄幼鼠各组织解剖图；图9为5日龄幼鼠各组织病理切片；图10为幼鼠攻毒后的平均体重变化；图11为幼鼠攻毒后存活情况；图12为P55CVB5毒株与不同代次33℃和37℃滴度比较情况；图13为Mock、JZ-P50、P55毒株免疫幼鼠后5日龄各组织解剖图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的细胞生物学和动物免疫的方法，这些方法是本领域普通技术员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本专利技术，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。实施例1Vero细胞的培养从液氮中取出一支Vero细胞(购买于ATCC，编号CCL-81),迅速放入37℃温水中，使细胞迅速解冻，然后1000rpm离心10min，轻轻的拿到超净台消毒，然后用1ml含10％的胎牛血清的MEM培养基(购买于GIBCOInvitrogen公司)重悬，加入到底面积35cm2的细胞培养瓶中，补加9ml的含10％的胎牛血清的MEM培养基，37℃封闭培养过夜。次日，弃掉细胞上清的培养基，加入新鲜的MEM培养基继续培养。等到细胞长成致密的单层后，加入PBS(购买于GIBCOInvitrogen公司)清洗细胞三次，倒掉后，加入1ml的胰酶消化液(购买于GIBCOInvitrogen公司)37℃消化10min，然后用MEM培养基将细胞重悬、吹散，按1：2-1：4的比例分装到细胞瓶中，37℃封闭培养，直至细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柯萨奇病毒减毒株，其特征在于，所述的柯萨奇病毒减毒株为柯萨奇病毒B组5型JZ‑P50株（Enterovirus coxsackie virus CVB5 JZ‑P50），保藏编号为CCTCC No：V201858。

【技术特征摘要】
1.一种柯萨奇病毒减毒株，其特征在于，所述的柯萨奇病毒减毒株为柯萨奇病毒B组5型JZ-P50株（Enteroviruscoxsackievirus...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵聪文，仉秋实，苑荣亮，井敏敏，王瑞博，杨骏宇，张娟，柯江伟，陈卫东，陈建敏，林先容，孙巍，张叶娇，栾晓丹，陈瑞琪，尹绍云，
申请(专利权)人：泰州赛华生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32