用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。本发明专利技术保护一种引物组合，包括13个引物对(26种引物)，26种引物依次如序列表的序列1至序列26所示。应用本发明专利技术提供的引物组合配套GeXP检测方法鉴定H5、H7和N9亚型组合9个NA亚型，具有高通量、快速、省时省力的优点，为快速鉴别H5、H7和N9亚型组合9个不同的NA亚型AIV提供了有效方法，应用前景广阔。

Primer combinations for detection of H5, H7, H9 and 9 NA subtypes of AIV and their applications

The invention discloses a primer combination for detecting H5, H7 and H9 and nine NA subtypes of AIV and its application. The invention protects a primer combination comprising 13 primer pairs (26 primers), 26 primers in turn as shown in sequence 1 to sequence 26 of sequence list. The primer combination matching GeXP detection method provided by the invention can identify nine NA subtypes of H5, H7 and N9 subtypes combination, which has the advantages of high throughput, fast, time-saving and labor-saving. It provides an effective method for rapid identification of nine different NA subtypes of H5, H7 and N9 subtypes combination, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。
技术介绍
禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科A型流感，根据HA和NA抗原性不同，目前，已在禽类发现16个HA亚型和9个NA亚型，近年，在蝙蝠发现第17、18个HA亚型和10、11个NA亚型。1997年香港出现人类感染H5N1亚型AIV死亡病例，并爆发疫情，使人“谈禽色变”，给养殖业造成严重的经济损失。近年来，AIV感染人的病例陆续有报道，2013年，在我国长三角地区发现H7N9感染人并致死的案例，并在全国大部分地区扩散开来，已引起5波的感染，目前，仍有H7N9感染人的报道，给公共卫生安全造成严重的威胁。H9N2是AIV分离中常见的亚型，为近年感染人的H7N9、H10N8提供基因片段。GeXP系统(GeneExpressionProfilerGeneticAnalysisSystem)多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段(DNASizeStandard,DSS)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。传统检测H5、H7和H9亚型AIV及其NA亚型AIV的方法主要是病毒分离培养，经血凝试验和血凝抑制试验确定HA亚型，再将NA基因克隆至载体测序确定NA亚型，但耗时长并需要特定的阳性血清。如果能够利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能够同时检测多种H亚型和N亚型禽流感病毒的方法及其配套试剂盒，对于AIV的有效防控将具有重要意义。想建立上述方法，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。但是，基于本领域技术人员的公知常识，设计可以在同一体系中对多个靶片段进行有效扩增的多重PCR的引物组合是非常困难的。目前，还没有基于GeXP系统的同时可检测H5、H7、H9、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9亚型AIV的试剂或试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用。本专利技术保护一种引物组合，包括如下13个引物对：引物对AIV-M由正向引物和反向引物组成，正向引物为(a1)、(a2)、(a3)或(a4)，反向引物为(b1)、(b2)、(b3)或(b4)；(a1)序列表的序列1所示；(a2)序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；(a3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(a4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(a3)和/或(a4)中，基因特异性引物如序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；(b1)序列表的序列2所示；(b2)序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；(b3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(b4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(b3)和/或(b4)中，基因特异性引物如序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；引物对H5由正向引物和反向引物组成，正向引物为(c1)、(c2)、(c3)或(c4)，反向引物为(d1)、(d2)、(d3)或(d4)；(c1)序列表的序列3所示；(c2)序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；(c3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(c4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(c3)和/或(c4)中，基因特异性引物如序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；(d1)序列表的序列4所示；(d2)序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；(d3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(d4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(d3)和/或(d4)中，基因特异性引物如序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；引物对H7由正向引物和反向引物组成，正向引物为(e1)、(e2)、(e3)或(e4)，反向引物为(f1)、(f2)、(f3)或(f4)；(e1)序列表的序列5所示；(e2)序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；(e3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(e4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(e3)和/或(e4)中，基因特异性引物如序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；(f1)序列表的序列6所示；(f2)序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；(f3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(f4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(f3)和/或(f4)中，基因特异性引物如序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；引物对H9由正向引物和反向引物组成，正向引物为(g1)、(g2)、(g3)或(g4)，反向引物为(h1)、(h2)、(h3)或(h4)；(g1)序列表的序列7所示；(g2)序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；(g3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(g4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(g3)和/或(g4)中，基因特异性引物如序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；(h1)序列表的序列8所示；(h2)序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；(h3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(h4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(h3)和/或(h4)中，基因特异性引物如序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；引物对N1由正向引物和反向引物组成，正向引物为(i1)、(i2)、(i3)或(i4)，反向引物为(j1)、(j2)、(j3)或(j4)；(i1)序列表的序列9所示；(i2)序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；(i3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(i4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(i3)和/或(i4)中，基因特异性引物如序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；(j1)序列表的序列10所示；(j2)序列表的序列10第20至38位核苷酸所示；(j3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(j4)自上游至下游依次由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合，包括如下13个引物对：引物对AIV‑M由正向引物和反向引物组成，正向引物为(a1)、(a2)、(a3)或(a4)，反向引物为(b1)、(b2)、(b3)或(b4)；(a1)序列表的序列1所示；(a2)序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；(a3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(a4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(a3)和/或(a4)中，基因特异性引物如序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；(b1)序列表的序列2所示；(b2)序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；(b3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(b4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(b3)和/或(b4)中，基因特异性引物如序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；引物对H5由正向引物和反向引物组成，正向引物为(c1)、(c2)、(c3)或(c4)，反向引物为(d1)、(d2)、(d3)或(d4)；(c1)序列表的序列3所示；(c2)序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；(c3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(c4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(c3)和/或(c4)中，基因特异性引物如序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；(d1)序列表的序列4所示；(d2)序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；(d3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(d4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(d3)和/或(d4)中，基因特异性引物如序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；引物对H7由正向引物和反向引物组成，正向引物为(e1)、(e2)、(e3)或(e4)，反向引物为(f1)、(f2)、(f3)或(f4)；(e1)序列表的序列5所示；(e2)序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；(e3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(e4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(e3)和/或(e4)中，基因特异性引物如序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；(f1)序列表的序列6所示；(f2)序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；(f3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(f4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(f3)和/或(f4)中，基因特异性引物如序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；引物对H9由正向引物和反向引物组成，正向引物为(g1)、(g2)、(g3)或(g4)，反向引物为(h1)、(h2)、(h3)或(h4)；(g1)序列表的序列7所示；(g2)序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；(g3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(g4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(g3)和/或(g4)中，基因特异性引物如序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；(h1)序列表的序列8所示；(h2)序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；(h3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(h4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(h3)和/或(h4)中，基因特异性引物如序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；引物对N1由正向引物和反向引物组成，正向引物为(i1)、(i2)、(i3)或(i4)，反向引物为(j1)、(j2)、(j3)或(j4)；(i1)序列表的序列9所示；(i2)序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；(i3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(i4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(i3)和/或(i4)中，基因特异性引物如序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；(j1)序列表的序列10所示；(j2)序列表的序列10第20至38位核苷酸所示；(j3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(j4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(j3)和/或(j4)中，基因特异性引物如序列表的序列10第20至38位核苷酸所示；引物对N2由正向引物和反向引物组成，正向引物为(k1)、(k2)、(k3)或(k4)，反向引物为(l1)、(l2)、(l3)或(l4)；(k1)序列表的序列11所示；(k2)序列表的序列11第19至35位核苷酸所示；(k3)自上游至...

【技术特征摘要】
1.引物组合，包括如下13个引物对：引物对AIV-M由正向引物和反向引物组成，正向引物为(a1)、(a2)、(a3)或(a4)，反向引物为(b1)、(b2)、(b3)或(b4)；(a1)序列表的序列1所示；(a2)序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；(a3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(a4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(a3)和/或(a4)中，基因特异性引物如序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；(b1)序列表的序列2所示；(b2)序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；(b3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(b4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(b3)和/或(b4)中，基因特异性引物如序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；引物对H5由正向引物和反向引物组成，正向引物为(c1)、(c2)、(c3)或(c4)，反向引物为(d1)、(d2)、(d3)或(d4)；(c1)序列表的序列3所示；(c2)序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；(c3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(c4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(c3)和/或(c4)中，基因特异性引物如序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；(d1)序列表的序列4所示；(d2)序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；(d3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(d4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(d3)和/或(d4)中，基因特异性引物如序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；引物对H7由正向引物和反向引物组成，正向引物为(e1)、(e2)、(e3)或(e4)，反向引物为(f1)、(f2)、(f3)或(f4)；(e1)序列表的序列5所示；(e2)序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；(e3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(e4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(e3)和/或(e4)中，基因特异性引物如序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；(f1)序列表的序列6所示；(f2)序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；(f3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(f4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(f3)和/或(f4)中，基因特异性引物如序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；引物对H9由正向引物和反向引物组成，正向引物为(g1)、(g2)、(g3)或(g4)，反向引物为(h1)、(h2)、(h3)或(h4)；(g1)序列表的序列7所示；(g2)序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；(g3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(g4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(g3)和/或(g4)中，基因特异性引物如序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；(h1)序列表的序列8所示；(h2)序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；(h3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(h4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(h3)和/或(h4)中，基因特异性引物如序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；引物对N1由正向引物和反向引物组成，正向引物为(i1)、(i2)、(i3)或(i4)，反向引物为(j1)、(j2)、(j3)或(j4)；(i1)序列表的序列9所示；(i2)序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；(i3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(i4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(i3)和/或(i4)中，基因特异性引物如序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；(j1)序列表的序列10所示；(j2)序列表的序列10第20至38位核苷酸所示；(j3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(j4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(j3)和/或(j4)中，基因特异性引物如序列表的序列10第20至38位核苷酸所示；引物对N2由正向引物和反向引物组成，正向引物为(k1)、(k2)、(k3)或(k4)，反向引物为(l1)、(l2)、(l3)或(l4)；(k1)序列表的序列11所示；(k2)序列表的序列11第19至35位核苷酸所示；(k3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(k4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(k3)和/或(k4)中，基因特异性引物如序列表的序列11第19至35位核苷酸所示；(l1)序列表的序列12所示；(l2)序列表的序列12第20至36位核苷酸所示；(l3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(l4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(l3)和/或(l4)中，基因特异性引物如序列表的序列12第20至36位核苷酸所示；引物对N3由正向引物和反向引物组成，正向引物为(m1)、(m2)、(m3)或(m4)，反向引物为(n1)、(n2)、(n3)或(n4)；(m1)序列表的序列13所示；(m2)序列表的序列13第19至41位核苷酸所示；(m3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(m4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(m3)和/或(m4)中，基因特异性引物如序列表的序列13第19至41位核苷酸所示；(n1)序列表的序列14所示；(n2)序列表的序列14第20至41位核苷酸所示；(n3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(n4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(n3)和/或(n4)中，基因特异性引物如序列表的序列14第20至41位核苷酸所示；引物对N4由正向引物和反向引物组成，正向引物为(o1)、(o2)、(o3)或(o4)，反向引物为(p1)、(p2)、(p3)或(p4)；(o1)序列表的序列15所示；(o2)序列表的序列15第19至40位核苷酸所示；(o3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(o4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(o3)和/或(o4)中，基因特异性引物如序列表的序列15第19至40位核苷酸所示；(p1)序列表的序列16所示；(p2)序列表的序列16第20至39位核苷酸所示；(p3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(p4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(p3)和/或(p4)中，基因特异性引物如序列表的序列16第20至39位核苷酸所示；引物对N5由正向引物和反向引物组成，正向引物为(q1)、(q2)、(q3)或(q4)，反向引物为(r1)、(r2)、(r3)或(r4)；(q1)序列表的序列17所示；(q2)序列表的序列17第19至38位核苷酸所示；(q3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(q4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(q3)和/或(q4)中，基因特异性引物如序列表的序列17第19至38位核苷酸所示；(r1)序列表的序列18所示；(r2)序列表的序列18第20至40位核苷酸所示；(r3)自上游至下游依次包括如下区段：GeXP通用引物和基因特异性引物；(r4)自上游至下游依次由如下区段组成：GeXP通用引物和基因特异性引物；(r3)和/或(r4)中，基因特异性引物如序列表的序列18第20至40位核苷酸所示；引物对N6由正向引物和反向引物组成，正向引物为(s1)、(s2)、(s3)或(s4)，反向引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，罗思思，黄娇玲，谢志勤，谢丽基，张民秀，李孟，王盛，李丹，曾婷婷，张艳芳，范晴，邓显文，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45