一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明专利技术提供的福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶，其序列是一种新的苯丙氨酸解氨酶基因序列，是金线莲主要药用成分黄酮类物质合成过程中的关键酶基因，在黄酮类化合物合成代谢途径中起重要作用。

A Phenylalanine Ammonia Lyase from Anemone roxburghii and Its Encoding Gene, Recombinant Vector, Recombinant Engineering Bacteria and Its Application

The invention provides a phenylalanine ammonia lyase and its coding gene, recombinant vector, recombinant engineering bacteria and application of Anemone roxburghii, belonging to the field of protein engineering technology. The phenylalanine ammonia-lyase sequence of Anemone roxburghii is a new phenylalanine ammonia-lyase gene sequence, which is the key enzyme gene in the synthesis of flavonoids, the main medicinal ingredient of Anemone roxburghii, and plays an important role in the pathway of flavonoid synthesis and metabolism.

【技术实现步骤摘要】
一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用
本专利技术涉及蛋白质工程
，具体而言，涉及一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用。
技术介绍
福建金线莲(Anoectochilusroxburghii)是多年生草本植物，生长在福建地区，属兰科开唇兰属金线莲种。福建金线莲中重要药理活性的物质主要为：黄酮类化合物，甾体类化合物，三萜类化合物，糖类成分，生物碱，强心甙类，酯类，牛磺酸，多种氨基酸，微量元素及无机元素等。在民间素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。其中，福建金线莲中的多糖、黄酮类化合物、甾体等被认为是重要的活性物质，这些物质的合成直接影响了福建金线莲的药用价值。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase，PAL)是黄酮类物质合成代谢途径中关键的酶基因。黄酮类化合物合成代谢途径中，最先催化的酶就是苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase,PAL)，它可以催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)生产反式肉桂酸(Trans-cinnamicacid)。产生的反式肉桂酸，在氧和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPH)同时存在的条件下，经过肉桂酸4-羟基酶(Cinnamicacid4-hydroxyenzyme,C4H)催化，可以生成4-羟基香豆酸(4-hydroxycinnamateacid)。接着4-羟基香豆酸-辅酶A连接酶(4-hydroxycinnamateacid-coenzymeAligase,4CL)催化连接，将前一步骤生成的4-羟基香豆酸转化为4-羟基香豆酰-CoA等硫酯，此步骤需要ATP提供能量。产生的4-羟基香豆酰-CoA可与丙二酰-CoA在查尔酮合酶的作用下反应，生成查尔酮(Chalcone)。之后进入黄酮合成代谢的5条支路(异黄酮支路、橙酮支路、黄酮支路、花青素支路和黄酮醇支路)。因此，苯丙氨酸解氨酶是植物连接主生和次生代谢的重要限速酶，在黄酮类化合物合成代谢途径中起重要作用，其活性与各种黄酮类化合物的合成代谢和积累密切相关。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶。本专利技术的第二目的在于提供一种福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因。本专利技术的第三目的在于提供一种含有福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组载体。本专利技术的第四目的在于提供一种含有福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组工程菌。本专利技术的第五目的在于提供一种福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因在表达苯丙氨酸解氨酶中的应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶，酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种编码如上述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因。一种含有上述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组载体。一种含有上述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组工程菌。上述福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因在表达苯丙氨酸解氨酶中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶，其序列是一种新的苯丙氨酸解氨酶基因序列，是金线莲主要药用成分黄酮类物质合成过程中的关键酶基因，在黄酮类化合物合成代谢途径中起重要作用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为基因CDS序列电泳检测结果图；图2为福建金线莲PAL预测的蛋白三级结构图；图3为福建金线莲PAL蛋白发生关系树分析；图4为基因不同组织表达模式图；图5为基因在4mg/LPhe下12h内的表达模式图；图6为基因在100mMNaCl下12h内的表达模式图；图7为基因在253.7nm紫外胁迫下12h内的表达模式图；图8为基因在红光胁迫下12h内的表达模式图；图9为瞬时表达载体pC2300-35S-PAL-eGFP；图10为福建金线莲PAL蛋白的亚细胞定位；图11为福建金线莲PAL基因southernbotting结果图；图12为转福建金线莲PAL基因拟南芥的筛选图；图13为转基因拟南芥的PCR检测图；图14为转基因拟南芥的总黄酮富集情况。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例一、为金线莲总叶片RNA的提取和纯化，总RNA提取使用大连宝生物有线公司的Trizol提取试剂盒，包括下述步骤：(1)分别取约100mg研磨后的粉末装入1.5mL离心管，然后立即加入1mLRNAisoPlus，颠倒混匀。(2)将充分混匀的匀浆液在室温静置5min，然后12000g，4℃离心5min。(3)吸取上清液800ml转入新的离心管中，切勿吸取沉淀，然后加入上清液体积200ml氯仿，并剧烈振荡混匀至匀浆液乳化呈乳白色，然后室温静置5min。(4)将混合液在12000g，4℃离心15min，此时匀浆液分为三层。从上至下分别是：上清液(含RNA)、中间的白色层(大部分为DNA)及有颜色的下层有机相。(5)吸取上清液400ml转移至新的离心管中，切勿触碰中间层。然后加入400ml的异丙醇并颠倒混匀，然后室温下静置10min。(6)将静置后的溶液在12000g，4℃离心10min，此时可见白色絮状的RNA。小心弃掉上清并加入1mL75％乙醇，上下颠倒洗涤RNA后弃去上清。(7)打开离心管盖室温干燥RNA几分钟后，加入30μl的RNase-free水溶解RNA。(8)使用超微量分光光度计(Bio-Rad，美国)测定A260的值来计算总RNA的浓度，读取OD260/OD280的值来估计总RNA纯度和完整性。用1.2％琼脂糖凝胶电泳，135V快速检测RNA质量。二、为福建金线莲的转录组测序，方法如下：提取福建金线莲叶片的总RNA，检测RNA提取质量，满足建库要求(RNA浓度>250ng/μL，总量>20μg，OD260/OD280在1.8～2.2之间，完整性良好，RIN>6.5)。然后，用磁珠富集poly(A)mRNA打断成段片段，以此为模板，依次合成第1条cDNA链和第2条cDNA链，经过纯化、洗脱、末端修复、加poly(A)后连接测序接头。选择200bp～700bp大小的片段进行PCR扩增，建立cDNA测序文库，用IIIuminaHiSeq2000进行测序。该部分实验委托美因科技服务有线公司完成。使用短reads组装软件Trinity(v2.4.0)做Denovo组装，得到不含N的Contig组装片段后，使用tgicl(v2.1)进行去冗余，除去序列中质量低、不确定的序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶，其特征在于，所述福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶，其特征在于，所述福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码如权利要求1所述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因。3.根据权利要求2所述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因，其特征在于，所述基因核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨琳，张君诚，付凤玲，李晚忱，宋育红，张杭颖，
申请(专利权)人：三明学院，
类型：发明
国别省市：福建,35