工程化苯丙氨酸解氨酶多肽制造技术

本申请涉及工程化苯丙氨酸解氨酶多肽。特别地，本申请提供了工程化苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia‑lyase，PAL)多肽及其组合物，以及编码工程化苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，工程化PLA多肽被优化以提供增强的催化活性、以及降低的对蛋白水解的敏感性和增加的对酸性pH水平的耐受性。在一些实施方案中，工程化PLA多肽被去免疫化(deimmunized)。本申请还涉及包含工程化PAL多肽的组合物用于治疗和工业目的的用途。

Engineering phenylalanine ammonia lyase polypeptide

This application relates to engineered phenylalanine ammonia lyase polypeptide. In particular, the application provides an engineered phenylalanine ammonia lyase (PAL) polypeptide and its composition, as well as a polynucleotide encoding an engineered phenylalanine ammonia lyase (PAL) polypeptide. In some implementations, engineered PLA polypeptides are optimized to provide enhanced catalytic activity, reduced sensitivity to protein hydrolysis, and increased tolerance to acidic pH levels. In some implementations, engineered PLA polypeptides are deimmunized. The application also relates to the use of compositions containing engineered PAL polypeptides for therapeutic and industrial purposes.

【技术实现步骤摘要】
工程化苯丙氨酸解氨酶多肽本申请是申请日为2014年4月17日，申请号为201480035201.3，专利技术名称为“工程化苯丙氨酸解氨酶多肽”的申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2013年4月18日提交的美国临时专利申请系列号61/813,586和2013年10月31日提交的美国临时专利申请系列号61/897,932的优先权，两者都通过引用以其整体被并入用于全部目的。对作为ASCII文本文件提交的“序列表”、表格，或计算机程序列表附件的引用写入文件CX7-131WO2_ST25.TXT中，创建日期为2014年4月15日，127,412个字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统的序列表在此通过引用并入。专利
本专利技术提供了工程化苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽及其组合物，以及编码工程化苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，工程化PAL多肽被优化以提供增强的催化活性，以及降低的对蛋白水解的敏感性和增加的对酸性pH水平的耐受性。在一些实施方案中，工程化PAL多肽被去免疫化。本专利技术还涉及包含工程化PAL多肽的组合物用于治疗和工业目的的用途。专利技术背景苯丙氨酸解氨酶(PAL)连同组氨酸解氨酶(HAL)和酪氨酸解氨酶(TAL)一起为芳香族氨基酸裂解酶家族(EC4.3.1.23-1.25和4.3.1.3)的成员。更具体地，具有PAL活性的酶(EC4.3.1.23-1.25和先前分类为EC4.3.1.5)催化L-苯丙氨酸的非氧化性脱氨基为(E)-肉桂酸。PAL为非哺乳动物酶，其广泛分布于植物中并且还在真菌和有限数目的细菌中被鉴定出。PAL酶可以被用作用于治疗代谢紊乱苯丙酮尿症(PKU)的治疗性蛋白。PKU是常染色体代谢遗传紊乱，其中肝酶苯丙氨酸羟化酶(PAH)或参与辅因子四氢生物蝶呤的合成或再循环的一种或更多种酶，由于在相应基因的一个中的突变而无功能。这种功能的缺乏导致血流中高水平的苯丙氨酸。苯丙氨酸被转化为苯丙酮酸盐(苯基酮)和其他衍生物。在人中，如果PKU未及早治疗，高水平的苯丙氨酸和其分解产物的部分可引起显著医学问题，所述医学问题包括智力障碍、小头畸形和癫痫发作。许多研究都集中在通过酶替代将PAL用于治疗PKU(Ambrus等人，Science201:837-839[1978]；Bourget等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，10:57-59[1984]；和Sarkissian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2339-2344[1999])。除去血流中苯丙氨酸的一种方法是使用可注射的重组PAL和通过聚乙二醇化修饰的PAL变体(PEG-PAL)。聚乙二醇化已被证明改进酶的半衰期并降低受试者抗原反应(参见例如，WO2008/153776、WO2011/097335和美国专利号7,531,341)。在PEG-PAL组合物中有用的PAL变体已经被描述为野生型点状念珠藻(Nostocpunctiforme)(NpPAL)；多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)(AvPAL)和圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)(RtPAL)的变体。特别地，已描述了野生型AvPAL的变体，其中在位置64、318、503和565处的半胱氨酸残基已用丝氨酸置换(参见例如，美国专利号：7,790,433；7,560,263；和7,537,923)。PAL施用作为减少PKU受试者中的L-苯丙氨酸的血浆浓度的方法的替代方案是非侵入性制剂，诸如口服制剂(Sarkissian等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2339-2344[1999])。口服递送PAL的关键优势是酶对免疫系统的减少的暴露，从而最小化用可注射PEG-PAL观察到的免疫反应。然而，关于PAL的口服制剂的主要限制是酶活性在胃和肠腔中的损失。为了有效而实用，PAL必须耐受酸性pH和蛋白酶的降解，所述蛋白酶诸如通常降解蛋白食物为寡肽和氨基酸的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和胃蛋白酶。在一些以前的研究中(Sarkissian，同上)，部分由于通过蛋白酶的酶降解且部分由于在pH7.0下相对低的比活性，为了实现口服施用PAL的显著效应，需要大量的酶。已经开发多种方法以抑制消化后的PAL降解(Kim等人，Molec.Therap.,10:220-224[2004]；和Shah等人,Int.J.Pharmaceut,356:61-68[2008])。提高PAL在消化道的苛刻条件下的效力的一种方法是提供耐受固有的苛刻条件的工程化PAL多肽。Kang等人使用胰凝乳蛋白酶裂解位点的定点诱变和AvPAL的表面赖氨酸的聚乙二醇化以减少蛋白水解失活(参见，Kang等人，Mol.Gen.Metabol.,99:4-9[2010])。在这些研究中，特异性突变了十个裂解位点，并且这些所得突变体除了两个(F18A和R94G)以外的所有都损失多于50％的原始酶活性。没有突变体显示出增加的活性，并且F18A突变体显示胰蛋白酶耐受性的轻微增加(Kang等人，同上)。用PAL的另外的研究，虽然有效，但通常没有导致较长存活的酶。因此，先前描述的PAL突变体及其衍生物的口服施用不会导致有效治疗PKU。尽管PAL的多种制剂取得了进展，对具有改进的特性的用于口服施用的PAL多肽仍存在需要。这些改进的特性包括但不限于较长的半衰期、增加的催化活性、改进的对消化道中条件的稳定性和减少的聚集。除了治疗应用以外，PAL酶还可用于工业合成L-苯丙氨酸和其他取代的L-苯丙氨酸衍生物。然后，这些衍生物可用作药物前体(Gloge等人，6:3386-3390[2000]；Bartsch等人，Prot.Eng.Des.Sel.,23:929-933[2010]；和Turner,Curr.Opin.Chem.Biol.,234-240[2011])。PAL酶还可用于农业应用。PAL在植物、真菌和细菌中的苯丙素(phenylpropanoid)(诸如类黄酮和木质素)生物合成中起着重要作用，并且可以用作防御相关酶(Bate等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7608-7612[1994])。通过使用具有PAL活性的重组多肽的PAL活性的调节可潜在地导致有效的除草剂。专利技术概述本专利技术提供了工程化苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽及其组合物，以及编码工程化苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，工程化PAL多肽被优化以提供增强的催化活性，以及降低的对蛋白水解的敏感性和增加的对酸性pH水平的耐受性。在一些实施方案中，工程化PAL多肽被去免疫化。本专利技术还涉及包含工程化PAL多肽的组合物用于治疗和工业目的的用途。在一些实施方案中，本专利技术涉及具有改进的特性的工程化苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽及其生物活性片段和类似物，所述改进的特性诸如增加的对酸性pH的耐受性和/或降低的对蛋白水解的敏感性。本专利技术涉及当在基本相同的条件下与野生型PAL酶或参考PAL多肽相比时具有改进的特性的工程化PAL多肽及其生物活性片段和类似物。本专利技术还涉及在治疗性和/或工业组合物中使用工程化PAL多肽及其生物活性片段和类本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的工程化多肽，所述工程化多肽由具有与参考序列SEQ ID NO:4至少97％的序列同一性的氨基酸序列组成并且所述工程化多肽与SEQ ID NO:4相比的氨基酸残基差异选自H307G/Q/M和下列置换中的一个或更多个：F18H、LL47A、L214Q、C503Q、C565P；并且所述工程化多肽与所述参考序列SEQ ID NO:4相比表现出选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性、ii)降低的对蛋白水解的敏感性、iii)增加的对酸性pH的耐受性、iv)降低的免疫原性、或i)、ii)、iii)和iv)的任何组合。

【技术特征摘要】
2013.04.18 US 61/813,586;2013.10.31 US 61/897,9321.一种具有苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的工程化多肽，所述工程化多肽由具有与参考序列SEQIDNO:4至少97％的序列同一性的氨基酸序列组成并且所述工程化多肽与SEQIDNO:4相比的氨基酸残基差异选自H307G/Q/M和下列置换中的一个或更多个：F18H、LL47A、L214Q、C503Q、C565P；并且所述工程化多肽与所述参考序列SEQIDNO:4相比表现出选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性、ii)降低的对蛋白水解的敏感性、iii)增加的对酸性pH的耐受性、iv)降低的免疫原性、或i)、ii)、iii)和iv)的任何组合。2.如权利要求1所述的工程化多肽，其中一个或更多个置换选自F18H、L4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉伽特·W·哈思曼，尼古拉斯·J·阿加德，本杰明·米杰茨，乔纳森·弗罗姆，张希云，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：美国,US