苏氨酸醛缩酶、突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了苏氨酸醛缩酶、突变体、苏氨酸醛缩酶和突变体的编码基因、编码基因构建的重组载体、重组载体转化获得的重组基因工程菌及苏氨酸醛缩酶和突变体在制备2‑/3‑/4‑位取代的苯丝氨酸衍生物中的应用。本发明专利技术以苏氨酸醛缩酶、突变体为生物催化剂，以2‑/3‑/4‑位取代的苯甲醛为底物，以5‑磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸/甘氨酸酯为辅底物，在适当条件和介质内进行酶催化反应，分离制备出一系列不同取代基的苯丝氨酸衍生物，该方法总收率范围在76‑99％，产物ee值大于99％，de值范围在70‑99％。

【技术实现步骤摘要】
苏氨酸醛缩酶、突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及苏氨酸醛缩酶、突变体及其在制备2-/3-/4-位取代的苯丝氨酸衍生物中的应用。
技术介绍
2-/3-/4-位取代的苯丝氨酸衍生物是一种重要的药物中间体和化工中间体，特别是4-甲砜基苯丝氨酸，广泛用于人类抗生素，家禽家畜类抗生素制备等，其代表药物如氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考等等。2-/3-/4-位取代的苯丝氨酸衍生物合成方法主要包括化学合成法和酶催化法。其中，化学合成法主要是通过加成反应，酯化反应和化学拆分法来得到手性的2-/3-/4-位取代的苯丝氨酸衍生物，虽然化学法操作简单，但是反应过程中用到了大量的水，重金属和剧毒的硫化氢，并且有大量的光学异构体作为副产物，不符合目前和将来国家提倡和推进的原子经济学和环境保护政策。而酶催化法具有条件温和，用水量少(仅为化学法的十分之一)，没有重金属污染，不使用剧毒化学品，手性选择高等诸多优点，具有很好的应用前景。苏氨酸醛缩酶有着十分广泛的应用潜力，它可以催化合成手性的医药关键中间体β-羟基-α-氨基酸。但是由于苏氨酸醛缩酶的稳定性不好，手性选择性特别是β本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.苏氨酸醛缩酶，其特征在于，选自假单胞菌(Pseudomonas putida)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；选自新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：19所示；选自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：23所示；选自单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：24所示；选自大肠杆菌(Escherichia coli)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：25所示；选自简达气单胞菌(Aeromonas jandaei)，其氨...

【技术特征摘要】
1.苏氨酸醛缩酶，其特征在于，选自假单胞菌(Pseudomonasputida)，其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示；选自新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)，其氨基酸序列为SEQIDNO：19所示；选自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)，其氨基酸序列为SEQIDNO：23所示；选自单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，其氨基酸序列为SEQIDNO：24所示；选自大肠杆菌(Escherichiacoli)，其氨基酸序列为SEQIDNO：25所示；选自简达气单胞菌(Aeromonasjandaei)，其氨基酸序列为SEQIDNO：26所示；选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其氨基酸序列为SEQIDNO：27所示；选自棉阿舒囊霉菌(Ashbyagossypii)，其氨基酸序列为SEQIDNO：28所示；选自鲍希瓦氏菌(Shewanellaloihica)，其氨基酸序列为SEQIDNO：29所示；选自维龙气单胞菌(Aeromonasveronii)，其氨基酸序列为SEQIDNO：30所示；选自硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)，其氨基酸序列为SEQIDNO：31所示。2.苏氨酸醛缩酶的突变体，其特征在于，是建立在不同菌株来源的苏氨酸醛缩酶的四个位点的突变，突变为单点突变、双点突变、三点突变或四点突变，其突变位点和原始位氨基酸列表如下：苏氨酸醛缩酶第一突变点第二突变点第三突变点第四突变点Ps_LTAN17H94S182T212Cc_LTAN14H91A178T206Ec_LTAT8H83A168S196Lm_LTA---H98A178Y206Tm_LTAT8H83A170S198Aj_LTAT10H85A170S198Sc_LTAT21H97A184S212Ag_LTAT22H98A185S213Sl_LTAT8H83A168S196Av_LTAT10H85A170S198Gs_LTAT10H85A170S198其对应可更换的氨基酸如下：第一突变点N/T更换为Q，第二突变点H更换为W/P/F/V/A/S，第三突变点S/A更换为Y，第四突变点T/S/Y更换为I；其中，不同菌株来源的苏氨酸醛缩酶定义如下：Ps_LTA-来源于假单胞菌(Pseudomonasputida)的苏氨酸醛缩酶，Cc_LTA-来源于新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)的苏氨酸醛缩酶，Ec_LTA-来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的苏氨酸醛缩酶，Lm_LTA-来源于单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的苏氨酸醛缩酶，Tm_LTA-来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的苏氨酸醛缩酶，Aj_LTA-来源于简达气单胞菌(Aeromonasjandaei)的苏氨酸醛缩酶，Sc_LTA-来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的苏氨酸醛缩酶，Ag_LTA-来源于棉阿舒囊霉菌(Ashbyagossypii)的苏氨酸醛缩酶，Sl_LTA-来源于鲍希瓦氏菌(Shewanellaloihica)的苏氨酸醛缩酶，Av_LTA-来源于维龙气单胞菌(Aeromonasveronii)的苏氨酸醛缩酶，Gs_LTA来源于硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)的苏氨酸醛缩酶；其中，氨基酸缩写含义如下：N-天冬酰胺，T-苏氨酸，Q-谷氨酰胺，H-组氨酸，W-色氨酸，P-脯氨酸，F-苯丙氨酸，V-缬氨酸，A-丙氨酸，S-丝胺酸，Y-酪氨酸，I-异亮氨酸。3.苏氨酸醛缩酶的突变体，其特征在于，选自假单胞菌(Pseudomonasputida)的苏氨酸醛缩酶的突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO：4，SEQIDNO：6，SEQIDNO：8，SEQIDNO：10所示；选自新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)的苏氨酸醛缩酶的突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO：20，SEQIDNO：21，SEQIDNO：22，SEQIDNO：32，SEQIDNO：33，SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喆明，张荣珍，谭昊，李利宏，
申请(专利权)人：王喆明，杭州法哲罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33