一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于共进化网络的ω‑转氨酶突变体以及制备方法和应用。该ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术获得的ω‑转氨酶突变体的半失活温度为42.2℃和43.8℃，比野生型酶提高3.7℃和5.3℃，在40℃下的半衰期为20.6min和26.0min，比野生型酶延长13.7min和19.1min。本发明专利技术利用蛋白质共进化网络指导ω‑转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω‑转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体，有效增加突变成功率，提高筛选工作量，提高实验效率。

_-aminotransferase mutant based on co-evolutionary network and its preparation and Application

The invention discloses a mutant of_aminotransferase based on co-evolution network, a preparation method and application thereof. The amino acid sequence of the_aminotransferase mutant is shown in SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.3. The semi-inactivation temperature of_aminotransferase mutant obtained by the method is 42.2 ~43.8 ~C, which is 3.7 ~5.3 ~C higher than that of wild-type enzyme, and the half-life of_aminotransferase mutant at 40 ~C is 20.6 min and 26.0 min, which is 13.7 min and 19.1 min longer than that of wild-type enzyme. The invention uses protein co-evolution network to guide the research of_aminotransferase, combines bioinformatics with computer software, predicts important sites affecting the structure and function of_aminotransferase, constructs mutation library, obtains mutants with further improvement of enzyme activity and thermal stability, effectively increases mutation success rate, improves screening workload and improves experimental efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用。
技术介绍
转氨酶是5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate,PLP)依赖性酶，广泛存在自然界中，能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，在细胞的氮代谢过程中发挥着重要作用。转氨酶作为生物催化剂可用于催化制备手性胺类化合物，作为合成治疗糖尿病药物、心血管药物、神经类药物、抗高血压药物和抗感染药物的重要中间体。根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-AT)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。另外转氨酶还具有较高区域选择性和立体选择性等优点。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力。来自土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-AT能催化(R)-(+)-α-甲基苄胺与酮酸反应生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。ω-转氨酶的催化过程如下所示：目前，关于分子改造ω-转氨酶提高其热稳定性的研究已有报道。例如：授权公告号为CN105441404B的专利技术专利文献公开了ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法，该专利技术利用温度因子结合能量优化策略对野生型ω-转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，筛选得到的突变体的半失活温度高达40.9℃，比野生型酶提高2.9℃。申请公布号为CN105950581A的专利技术专利申请文献公开了一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用，该专利技术根据ω-转氨酶的三维结构模型，分析蛋白质结构中B-factor数据，结合键长、键角、能量等生物信息学特征，使用生物信息学计算软件DisulfidebyDesign对该酶进行引入二硫键的理性设计，选出二硫键潜在的引入位点；然后结合相应位点B-factor值，选择该蛋白的不稳定区域引入二硫键，设计定点突变引物，以ω-转氨酶基因为模板，进行定点突变，PCR扩增、纯化后，筛选得到含有一个半胱氨酸的突变体，再以该突变体为模板，进行定点突变得到同时含有两个半胱氨酸的突变体，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；最后从所述定点突变文库中筛选效果较好的ω-转氨酶突变体。该方法ω-转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillusterreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。申请公布号为CN107058256A的专利技术专利申请文献公开了ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用，该专利技术依据在自然进化过程中，同源蛋白质的氨基酸序列某些特定位置向蛋白质结构和功能有利的方面趋于一致的机制，利用生物信息学技术筛选出与待改造生物酶同源的序列，并进行序列一致性分析，确定待改造生物酶中与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为突变对象，进而利用定点突变技术进行改造。虽然，通过上述分子改造方法获得的突变体在一定程度上提高了野生型ω-转氨酶的热稳定性，但是上述ω-转氨酶仍有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用，利用蛋白质共进化网络指导ω-转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω-转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体。具体技术方案如下：一种ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。第一种ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸，该ω-转氨酶突变体(L118A)的半失活温度为42.2℃，比野生型酶提高3.75.3℃；ω-转氨酶突变体(L118A)在40℃下的半衰期为20.6min，比野生型酶延长13.7min。第二种ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为苏氨酸，该ω-转氨酶突变体(L118T)的半失活温度为43.8℃，比野生型酶提高5.3℃；ω-转氨酶突变体(L118T)在40℃下的半衰期为26.0min，比野生型酶延长19.1min。本专利技术还提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。本专利技术提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示。其中，ω-转氨酶突变体的核苷酸序列变化情况为：将编码野生型ω-转氨酶第118位亮氨酸的密码子TTG分别突变为GCG和ACC。本专利技术还提供了一种所述基因的表达单元。本专利技术还提供了一种所述表达单元的重组质粒。本专利技术还提供了一种所述重组质粒的转化子。在蛋白质进化过程中，一些相互作用的氨基酸残基之间存在一种“共进化”(co-evolving)模式，形成了所谓的“共进化网络”，即当一个氨基酸残基发生变异时，与其相关联一个或多个氨基酸残基也要发生相应的变异，以维持蛋白质整体的空间结构以及生物学功能。本专利技术还提供了一种ω-转氨酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(1)利用NCBI数据库中的多重序列比对工具，获得与野生型ω-转氨酶同源的转氨酶家族序列；(2)利用共进化互信息模型对转氨酶家族序列进行分析，得到转氨酶家族的共进化网络，将共进化网络投射到野生型ω-转氨酶上，并根据不同位点上氨基酸残基之间的互信息，筛选出影响野生型ω-转氨酶结构和功能的相关氨基酸位点，作为待突变的氨基酸残基位点；(3)根据待突变的氨基酸残基位点，设计定点突变引物，以野生型酶基因为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；(4)从定点突变文库中筛选获得热稳定性提高的ω-转氨酶突变体。进一步地，所述的野生型ω-转氨酶为分离自土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶；得到的ω-转氨酶突变体对应的定点突变引物为：L118A-F：5’-GCATTTGTTGAAGCGATAGTCACCCG-3’；L118A-R：5’-GCGGGTGACTATCGCTTCAACAAATGCATC-3’；或者，L118T-F：5’-GGGATGCATTTGTTGAAACCATAGTCACCCGCGGTC-3’；L118T-R：5’-GACCGCGGGTGACTATGGTTTCAACAAATGCATCCC-3’。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术利用蛋白质内氨基酸共进化网络指导转氨酶的理性改造，在丙氨酸扫描基础上结合定点饱和突变，以获得热稳定性提高的突变体；获得的ω-转氨酶突变体的半失活温度为42.2℃和43.8℃，比野生型酶提高3.7℃和5.3℃，在40℃下的半衰期为20.6min和26.0min，比野生型酶延长13.7min和19.1min。(2)利用蛋白质共进化网络指导ω-转氨酶的研究，将生物信息学与计算机软件相结合，预测影响ω-转氨酶结构和功能作用的重要位点，构建突变文库，以获得酶活及热稳定进一步改善的突变体，有效增加突变成功的概率，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ω‑转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4所示。4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达单元。5.一种包含权利要求4所述表达单元的重组质粒。6.一种包含权利要求5所述重组质粒的转化子。7.一种ω-转氨酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用NCBI数据库中的多重序列比对工具，获得与野生型ω-转氨酶同源的转氨酶家族序列；(2)利用共进化互信息模型对转氨酶家族序列进行分析，得到转氨酶家族的共进化网络，将共进化网络投射到野生型ω-转氨酶上，并根据不同位点之间的互信息，筛选出影响野生型ω-转氨酶结构和功能的相关氨基酸位点，作为待突变的氨基酸残基位点；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，梅乐和，朱婉丽，吕常江，胡升，赵伟睿，王宏鹏，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33