The invention provides a method for collecting ovine oocyte and cumulus granulosa cells for sequencing single-cell RNA. By collecting ovine oocyte and cumulus granulosa cells separately, the uniformity of sampling space can be ensured without grinding the whole ovary. The collected oocytes and cumulus granulosa cells can be directly used for RNA extraction or high-throughput sequencing of various transcriptomes. Compared with the existing methods for RNA extraction and gene expression comparison from the whole ovary of sheep, the most important feature of the present invention is that the sampling time and space are accurate, and the accuracy of ovarian sampling for molecular testing can be further improved.
【技术实现步骤摘要】
用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法
本专利技术涉及一种用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法。
技术介绍
雌性绵羊早在胚胎时期,卵原细胞就已陆续分化而产生了初级卵母细胞;在绵羊性成熟前,初级卵母细胞一直停留在第一次减数分裂的前期Ⅰ时期而不再生长发育。直到绵羊进入性成熟期,初级卵母细胞受到性激素刺激后才逐渐苏醒,并在每一个发情期内重新继续生长发育和分裂。在绵羊繁殖研究中,由于不同品种绵羊卵巢的调节机制差异,导致存在着季节性发情和常年发情的区别;且一个情期内绵羊卵巢中有时仅排出单个卵母细胞,有时排出多个卵母细胞,进而造成单羔和多羔的现象。多种排卵现象集中于绵羊一个物种之中,绵羊因此可作为一种研究卵巢排卵机制差异的优秀模式动物。近年来,随着二代高通量测序技术的兴起,不少学者为研究绵羊的排卵机制差异,都采取将整个绵羊卵巢进行RNA提取后送样测序。测序所获得的结果比较差强人意,究其原因主要在于采样方案不够精细化,未能使得所采集的样品处于单一因素条件下比较。卵巢中除了有着丰富的静脉、动脉微血管、淋巴管和神经丛外,还有着卵巢冠、囊状附件、卵巢旁体、结缔组织、卵泡膜、颗粒细胞和各级卵母细胞等,目前所采取的整个卵巢研磨提取RNA后的测序办法,首先未能筛选出关键致因基因的表达量差异,其次若能筛选出一些潜在基因也不能从空间上很好的定位识别。事实上,绵羊卵母细胞发育及排卵机制主要与卵母细胞自身和其周围的卵丘颗粒细胞相关联。为满足试验研究可操作性要求,实施同期发情后可统一采样。由于RNA表达的时空特异性特点,故在理想条件下应严格控制采样的时间和空 ...
【技术保护点】
1.用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)从屠宰场获取新鲜的母羊卵巢,经消毒后,选择直径大于3mm的单个卵泡,用装有预热DPBS缓冲液的注射器抽取卵泡液,得到卵泡液‑DPBS液;(2)去掉注射器针头,将卵泡液‑DPBS液从注射器推出至培养皿中,将装有卵泡液‑DPBS液的培养皿放置于热台上,在体视镜下观察,选取卵丘颗粒细胞包裹较好的CoCs;(3)用口吸管将CoCs转移至装有预热透明质酸酶溶液的培养皿中,然后用移液器反复吹打,直至在体视镜下观察到卵丘颗粒细胞全部脱尽,卵母细胞裸露出透明带为止;裸露的卵母细胞通过口吸管转移至预热的DPBS缓冲液中清洗,余下的溶液用于提取卵丘颗粒细胞;(4)用口吸管将步骤(3)中经DPBS缓冲液清洗后的卵母细胞转移至预热的链霉蛋白酶溶液液滴中作用一段时间,在体视镜下观察,直至可见透明带变形,但尚未开始消融,立即将卵母细胞通过口吸管转移至预热的DPBS缓冲液中清洗,进行后续细胞裂解及RNA提取操作;(5)步骤(3)中余下的溶液经离心,弃上清,收集卵丘颗粒细胞沉淀,加入预热的DPBS缓冲液重悬,然后进行细胞裂解及 ...
【技术特征摘要】
1.用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)从屠宰场获取新鲜的母羊卵巢,经消毒后,选择直径大于3mm的单个卵泡,用装有预热DPBS缓冲液的注射器抽取卵泡液,得到卵泡液-DPBS液;(2)去掉注射器针头,将卵泡液-DPBS液从注射器推出至培养皿中,将装有卵泡液-DPBS液的培养皿放置于热台上,在体视镜下观察,选取卵丘颗粒细胞包裹较好的CoCs;(3)用口吸管将CoCs转移至装有预热透明质酸酶溶液的培养皿中,然后用移液器反复吹打,直至在体视镜下观察到卵丘颗粒细胞全部脱尽,卵母细胞裸露出透明带为止;裸露的卵母细胞通过口吸管转移至预热的DPBS缓冲液中清洗,余下的溶液用于提取卵丘颗粒细胞;(4)用口吸管将步骤(3)中经DPBS缓冲液清洗后的卵母细胞转移至预热的链霉蛋白酶溶液液滴中作用一段时间,在体视镜下观察,直至可见透明带变形,但尚未开始消融,立即将卵母细胞通过口吸管转移至预热的DPBS缓冲液中清洗,进行后续细胞裂解及RNA提取操作;(5)步骤(3)中余下的溶液经离心,弃上清,收集卵丘颗粒细胞沉淀,加入预热的DP...
【专利技术属性】
技术研发人员:王翔宇,储明星,郭晓飞,狄冉,刘秋月,胡文萍,贺小云,
申请(专利权)人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,
类型:发明
国别省市:北京,11
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