一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法，所述方法包括在体外成熟过程中至少更换一次体外成熟液的步骤，以及进一步的包括在体外成熟液中添加一定量的FGF。本发明专利技术的方法制备的卵母细胞具有显著提高的细胞核成熟效率和细胞胞质成熟效率，MII期卵母细胞高达95％，皮质颗粒和线粒体正常分布的卵母细胞比例、谷胱甘肽和ATP水平均显著高于正常成熟组；在体外成熟液中添加一定量的FGF，可进一步提高了卵母细胞的成熟质量和效率。本发明专利技术的方法制备的卵母细胞经体外受精之后，体外受精效率显著高于正常成熟组，体现为更高的卵裂率、囊胚率和更多的囊胚细胞数，具有重大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及哺乳动物卵母细胞体外成熟效率的方法
技术介绍
卵母细胞体外成熟(IVM)，是家畜胚胎生物技术的关键环节，也是体外受精技术(IVF)的重要组成部分。然而与体内环境相比，已有的卵母细胞IVM体系仍不完善，进而导致IVM卵母细胞的质量较低。大量研究表明，现有技术的方法中IVM卵母细胞的质量，例如受精能力、发育能力、胚胎移植后的产子能力，都显著低于体内成熟的卵母细胞(ShiJM等，JPinealRes,2009；47(4):318-323；LonerganP等，AnnuRevAnimBiosci,2016；4:255-268)。IVM卵母细胞较低的质量和发育潜力，已经成为限制胚胎生物技术效率的瓶颈，亟待解决。在体内环境下，家畜卵母细胞的生长和成熟都是在下丘脑-垂体-性腺轴分泌激素的精确调控进行的，这些激素包括垂体促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、雌激素(E2)等。在牛发情周期中，FSH的浓度于发情前12天左右开始上升、在发情前1～2天出现峰值，而LH的浓度则在发情后12h急剧上升并达到峰值、之后处于较低水平。而E2的浓度则在发情前两天开始升高，发情开始12h后达到峰值，随后开始下降，且在发情后第5～9天出现第二个峰值。由此可见，在卵母细胞体内成熟过程中，上述调控卵母细胞成熟进程的激素水平是动态变化的。目前，卵母细胞IVM体系是通过模仿家畜体内环境来配制的，一般都由基础液(M199)、血清(FBS)、以及生殖激素等构成，生殖激素包括FSH、LH、E2，其中FSH的作用可促卵丘细胞扩展、胞质成熟等，而LH可提高卵母细胞核成熟率、受精率和发育率。牛卵母细胞IVM程序通常为：将从卵巢表面获取的卵丘卵母细胞复合体(COCs)放入IVM液中，在38.5℃、5％CO2培养箱中成熟24h，在该期间IVM体系无任何变化。由于目前采用的牛卵母细胞体外成熟的方法，并不能为卵母细胞体外成熟提供最佳的激素环境，因此势必会对卵母细胞成熟质量和效率产生影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中体外成熟方法导致的卵母细胞成熟质量和效率较低的问题，提供一种可以有效提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法，其特征在于，所述方法包括在体外成熟过程中至少更换一次体外成熟液的步骤。本专利技术的方法中，所述卵母细胞优选为牛卵母细胞。本专利技术的方法中，优选每4-20小时更换一次体外成熟液，更优选地，每8-16小时更换一次体外成熟液，最优选地，每8-12小时更换一次体外成熟液。以体外成熟培养24小时计，每8小时更换一次体外成熟液表示在培养开始后第8小时、第16小时更换体外成熟液；每12小时更换一次体外成熟液表示在培养开始后第12小时更换一次体外成熟液。本专利技术的方法中，更换体外成熟液时可更换全部成熟液；在一些实施方式中，可更换至少50％、60％、70％、80％或90％的成熟液。本专利技术的方法中，体外成熟液的组分包括：TCM199基础培养液，0.01IU/mLFSH，10μg/mL肝素，40ng/mLIGF，50ng/mLEGF，0.01IU/mLLH，1μg/mLE2和10％FBS。本专利技术的方法中，体外成熟液并不局限于上述组分及含量，现有技术中其他的包含基础培养液和生殖激素的体外成熟液，也均适用于本专利技术。进一步的，本专利技术的方法中，体外成熟液中还包含了FGF(成纤维细胞生长因子)，所述FGF的浓度为10-30ng/mL；优选的，所述FGF的浓度为20ng/mL。第二方面，本专利技术提供了通过上述方法所制备的体外成熟的卵母细胞。进一步的，所述体外成熟的卵母细胞为牛卵母细胞。采用本专利技术的方法所制备的卵母细胞，相对于未更换体外成熟液的方法，MII期卵母细胞的比率显著提高，皮质颗粒和线粒体正常分布的比例、谷胱甘肽和ATP的水平均显著提高，表示本专利技术的方法制备的卵母细胞具有更高的成熟质量和效率。第三方面，本专利技术提供了所制备的体外成熟的卵母细胞在体外受精中的应用。采用本专利技术的方法制备的卵母细胞在体外受精(IVF)之后，相对于未更换体外成熟液的方法，卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均显著提高，表示本专利技术的方法制备的卵母细胞及受精卵质量更高，实际应用价值更大。本专利技术通过在卵母细胞成熟过程中更换体外成熟液，克服了现有技术的方法中因生殖激素存在半衰期而导致的卵母细胞体外成熟质量和效率低下的问题，从而提供了一种操作简便，重复性高，显著提高卵母细胞成熟质量和效率的方法。采用本专利技术的方法制备的卵母细胞，具有显著提高的细胞核成熟效率和细胞胞质成熟效率，MII期卵母细胞高达95％，皮质颗粒和线粒体正常分布的卵母细胞比例、谷胱甘肽和ATP水平均显著高于正常成熟组；在体外培养液中添加一定量的FGF，可进一步提高了卵母细胞的成熟质量和效率。本专利技术的方法制备的卵母细胞经体外受精之后，体外受精效率显著高于正常成熟组，体现为更高的卵裂率、囊胚率和更多的囊胚细胞数；在体外培养液中添加一定量的FGF，可进一步提高了卵母细胞体外受精的效率，具有重大的实际应用价值。附图说明图1.卵母细胞中皮质颗粒分布情况。图中A、B、C、D分别为环形分布、不连续分布、胞质均匀分布和完全释放，其中A为正常分布。标尺＝20μm。图2.卵母细胞中线粒体分布情况。图中A、B、C分别为环形分布、均匀分布和异常分布，其中A、B为正常分布。标尺＝20μm。图3.COCs成熟照片。A：20ng/mLFGF+12h换液组，B：正常成熟组。放大倍数：200x。具体实施方式下面结合实施例详细介绍本专利技术，本专利技术的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本专利技术要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本专利技术提供的具体实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本专利技术的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本专利技术所附权利要求书的保护范围之内。试剂和仪器：除特殊说明，本专利技术所有实验试剂均购于Sigma公司(美国)，奶牛冻精购自北京奶牛中心。实施例1卵母细胞的获取和体外成熟方法1.卵母细胞的获取与体外成熟从屠宰场获取的卵巢，放入37℃生理盐水中2h内运到实验室。通过真空泵，抽出直径在2-8mm卵泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，IVM液洗涤后在显微镜下检出，然后将COCs放入IVM液中在38.5℃、5％CO2的培养箱中培养24h。其中，IVM液成分如下：TCM199基础培养液+0.01IU·mL-1FSH+10μg·mL-1肝素+40ng·mL-1IGF+50ng·mL-1EGF+0.01IU·mL-1LH+1μg·mL-1E2+10％FBS。2.卵母细胞核成熟统计各组卵母细胞IVM24h后，采用透明质酸酶脱除卵丘细胞，挑选MII期卵母细胞，进而统计MII期卵母细胞比例。3.卵母细胞胞质成熟统计选取各组MII期卵母细胞，进行皮质颗粒、线粒体分布和谷胱甘肽、ATP水平分析。皮质颗粒分析程序：用链霉蛋白酶(5mg/mL)消化卵母细胞，除去透明带后，在DBPS溶液中清洗3次，然后室温固定在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述方法包括在体外成熟过程中至少更换一次体外成熟液的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述方法包括在体外成熟过程中至少更换一次体外成熟液的步骤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞为牛卵母细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每4-20小时更换一次体外成熟液。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，每8-12小时更换一次体外成熟液。5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述更换一次体外成熟液为更换全部...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵学明，朱化彬，郝海生，杜卫华，庞云渭，张燕，刘岩，赵亚涵，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11