一种多特异性Fab融合蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术提供了特异性结合CD3和EpCAM的多特异性Fab融合蛋白(MSFP)，本发明专利技术还提供了所述MSFP在制备药物组合物中的用途、治疗癌症的方法和包含MSFP的试剂盒。还提供了抗EpCAM抗体或其抗原结合片段。

A Multi-specific Fab Fusion Protein and Its Application

The invention provides a multispecific Fab fusion protein (MSFP) specifically binding CD3 and EpCAM, and also provides the use of the MSFP in the preparation of pharmaceutical compositions, the method for treating cancer and the kit containing MSFP. Anti-EpCAM antibodies or their antigen binding fragments are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种多特异性Fab融合蛋白及其用途相关申请的交叉引用本申请要求于2016年3月15日提交的中国专利申请号201610147227.8的优先权，所述申请全部内容通过引用以其整体并入本文。序列表文本文件以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：720622000841SEQLIST.txt；记录日期：2017年3月13日，大小48KB)。
本专利技术涉及特异性结合CD3和EpCAM的多特异性Fab融合蛋白(MSFP)，本专利技术还提供了包含所述Fab融合蛋白的药物组合物、使用所述MSFP治疗癌症的方法和包含所述MSFP的试剂盒。
技术介绍
某些抗原在肿瘤组织中过度表达、突变或选择性突变。因而，靶向癌细胞表面特异性抗原的抗体可用作癌症治疗药。上皮细胞粘附因子(EpCAM，CD326)是一种分子量为40KD的跨膜糖蛋白，也被称为17-1A、ESA、AUA1、EGP40等，具有314个氨基酸。EpCAM在多种上皮细胞和主要类型的人类恶性肿瘤中特异表达。例如，EpCAM在结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌以及卵巢癌中均高表达。因而，EpCAM已成为癌症治疗中的热点靶点，包括疫苗、鼠源或人源单克隆抗体，以及与细菌毒素或化疗药缀合的抗体，如EpCAM特异性的抗体ING-1、阿德木单抗(Adecatumumab)、依决洛单抗(edrecolomab)等。CD3(其包含3条不同多肽链(ε、δ和γ链))是由T细胞表达的抗原。3条CD3多肽链与T细胞受体(TCR)和ζ链结合以形成TCR复合物，其具有活化T细胞中信号转导级联的功能。目前，多种治疗策略靶向TCR信号转导，以使用抗人CD3单克隆抗体治疗疾病。CD3特异的抗体OKT3是第一个批准用于人类治疗用途的单克隆抗体，在临床上作为免疫调节剂用于治疗同种异体移植物排斥。在过去二十年中，在双特异性抗体领域的努力已逐渐获得临床上的成功。在2009年，Cantomaxomab(抗-CD3，抗-EpCAM三功能性抗体)在欧盟被批准用于治疗有症状的恶性腹水。然而，虽然已显示双特异性抗体在有效杀伤癌细胞方面具有潜力，但是严重的副作用(包括全身免疫激活、免疫原性(抗药物抗体作用)和这些分子的普遍较差的可生产性)已极大地限制了此类药物的广泛应用。CD19xCD3双特异性scFv-scFv(单链可变区片段)融合蛋白(博纳吐单抗(Blinatumomab))的另一个缺点是，由于其半衰期短且不兼容皮下施用，这种药物需要每日静脉内(i.v.)施用；然而，在临床试验过程中仍发生了神经学反应，如定向障碍、错乱、言语障碍、震颤或抽搐(Science321:974-977，2008)。为了更好地控制这些不希望发生的副作用，在更长时间段中以连续输注静脉内施用双特异性单链抗体(BiTE)。US20120244161公开了EpCAM×CD3双特异性scFv-scFv融合蛋白(MT110)的I期临床试验，其中应用了低剂量(1-12μg/kg/24小时)静脉连续输注长时间段，并且在MT110输注或剂量增加前施用糖皮质激素。此外，scFv-scFv融合蛋白有聚集的倾向。目前的双特异性抗体形式的缺点对于这些药物以良好的有效性和安全性广泛应用于治疗癌症患者仍然是巨大的挑战。因此，本领域存在迫切需要开发具有改善的功效、稳定性、安全性和可生产性的新的双特异性抗体或治疗方案。专利技术简述本专利技术提供了一种特异性结合CD3和EpCAM的多特异性Fab融合蛋白(如双特异性Fab蛋白(BSFP))，以及使用所述多特异性Fab融合蛋白(MSFP)治疗癌症的方法。在本专利技术的一个方面，提供了一种治疗个体(如人类个体)中的癌症的方法，所述方法包含对个体施用有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域，其中所述结合域与所述Fab片段N端连接，其中所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述结合域是scFv。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中所述第一scFv与所述Fab片段VH的N端融合，所述第二scFv与所述Fab片段VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同的序列。根据任意一种前文所述方法，在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率(如少于约1、2、3、4、6、9、或12个月一次中的任何，如单次施用)施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴约0.1μg/kg至约100μg/kg(如约0.3μg/kg至约5μg/kg，或约5μg/kg至约20μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以不引起细胞因子风暴的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴不高于约30μg/kg(如不高于约20μg/kg、10μg/kg或1μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述个体是人类个体。根据任意一种前文所述方法，在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以第一剂量施用于个体第一时间段，并且随后，所述多特异性Fab融合蛋白以第二剂量施用于个体第二时间段，并且其中所述第二剂量超过所述第一剂量。在一些实施方式中，所述第二时间段超过所述第一时间段。在一些实施方式中，所述第一时间段为至少约7天。在一些实施方式中，所述第二时间段为至少约2周。在一些实施方式中，所述第一剂量不超过约1μg/kg。在一些实施方式中，所述第二剂量为约0.1μg/kg至约10μg/kg。根据任意一种前文所述方法，在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素。在一些实施方式中，所述糖皮质激素是地塞米松。在一些实施方式中，所述糖皮质激素在所述多特异性Fab融合蛋白的第一剂量之前施用。在一些实施方式中，所述糖皮质激素以约0.1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用。根据任意一种上述的方法，在一些实施方式中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端，如CD3ε的氨基酸1-27内的表位。在一些实施方式中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方式中，所述Fab片段的VL包含：包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述Fab片段的VH包含与选自SEQIDNO:7和39-43的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段的VL包含与选自SEQIDNO:8和44-47的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多特异性Fab融合蛋白在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，并且其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg到约250μg/kg的剂量施用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.15 CN 20161014722781.一种多特异性Fab融合蛋白在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，并且其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg到约250μg/kg的剂量施用。2.如权利要求1所述的用途，其中，所述结合域是scFv。3.如权利要求2所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，所述第一scFv与Fab片段的VH的N端融合，所述第二scFv与Fab片段的VL的N端融合。4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。5.如权利要求1-4任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。6.如权利要求1-5任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以第一剂量施用于个体第一时间段，并且连续地，所述多特异性Fab融合蛋白以第二剂量施用于个体第二时间段，并且其中所述第二剂量超过所述第一剂量。7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中，进一步包括对所述个体施用糖皮质激素。8.如权利要求7所述的用途，其中，所述糖皮质激素是地塞米松。9.如权利要求1-8任一项所述的用途，其中，所述个体是人类个体。10.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端。11.如权利要求10所述的用途，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的氨基酸1-27内的表位。12.如权利要求11所述的用途，其中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中所述Fab片段的VL包含：包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-L3。13.如权利要求11或权利要求12所述的用途，其中，所述Fab片段的VH包含选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:7和39-43，和/或所述Fab片段的VL包含选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:8和44-47。14.如权利要求11-13任一项所述的用途，其中，所述的Fab片段包含人免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)，所述重链恒定区1(CH1)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列。15.如权利要求11-14任一项所述的用途，其中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区，所述人λ轻链恒定区包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。16.如权利要求11-15任一项所述的用途，其中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或多个二硫键连接。17.如权利要求16所述的用途，其中，所述Fab片段包含第一多肽和/或第二多肽，所述第一多肽包含SEQIDNO:11的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。18.如权利要求1-17任一项所述的用途，其中，所述癌症是EpCAM阳性实体癌。19.如权利要求18所述的用途，其中，所述EpCAM阳性实体癌是癌瘤(carcinoma)或腺癌(adenocarcinoma)。20.如权利要求1-19任一项所述的用途，其中，所述癌症选自下组：小肠癌，结肠直肠癌，肺癌，宫颈癌，肝癌，胃癌，胰腺癌，皮肤癌，肾癌，膀胱癌，甲状腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，乳腺癌，胆管癌和头颈癌。21.如权利要求20所述的用途，其中，所述癌症是结肠直肠腺癌。22.如权利要求20所述的用途，其中，所述癌症是肺腺癌。23.如权利要求2-22任一项所述的用途，其中，所述scFv的VH包含：包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H2...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔玉敏，黄智华，陈汉阳，张新峰，戚波，严孝强，
申请(专利权)人：健能隆医药技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31