Site-specific modification of proteins with microbial transglutaminase (MTG) is a powerful and versatile strategy for controlled modification of proteins under physiological conditions. Our evidence suggests that solid-phase microsphere immobilization can be used to site-specific and effectively link therapeutic-related proteins, including scFV, Fab fragments and antibodies, to further downstream applications of important functional molecules. We have demonstrated that MTG remains firm and has no detectable column loss, and the enzyme activity remains during continuous operation, allowing easy recycling of enzymes, thus exceeding MTG conjugation in solution phase. In addition, it is shown that fixed MTG exhibits selectivity to enhance certain residues in the presence of several reactive residues, which are targeted if conjugated in solution. Site-specific lysine conjugation using a highly efficient glutamine-containing peptide antagonist using fixed and solution MTG was also reported. In addition, the site-specific binding of IgG1 with glutamine and lysine residues of IgG1 antibody was reported. Site-specific glutamine binding with small peptides containing lysine residues and functional fractions was also described.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用固相固定的微生物转谷氨酰胺酶MTG和溶液中的MTG对抗体赖氨酸残基的位点特异性缀合本专利技术涉及使用微珠固定的MTG(微生物转谷氨酰胺酶MTG)和/或溶液中的MTG聚合物缀合物和/或溶液中的游离MTG使有机分子与蛋白质缀合并产生融合蛋白质的方法。近年来,蛋白质的酶促位点特异性官能化已经在生物缀合领域引起了相当大的兴趣。通过酶进行的生物缀合反应通常显示出在低试剂浓度(亚毫摩尔)下的快速动力学、高转化效率并且可以在生理条件下进行。尽管有这些益处,但随后必须从混合物中除去酶以避免任何下游干扰并因此损失。通过固相固定,可以通过简单的酶回收来避免这种情况。迄今为止,酶的固定的几乎仅应用于小化合物的转化,并且据报道,其增强酶的稳定性并且还可以导致提高的活性、选择性或选择性。尚未报道在不同蛋白质形式的数轮缀合的连续操作下对大分子量底物例如蛋白质进行位点特异性修饰的固定化酶的可调性质(即对某些残基增强的选择性)。最近Policarpo等表明酶与Ni-NTA琼脂糖珠的缀合。不幸的是,这种缀合具有非共价性质并且显示出柱流失的高风险。因此,本专利技术的目的是提供这样的方法,该方法提供用于在活性流动反应器柱或旋转柱中使用以实现高速率的牢固固定的酶和/或在溶液中的酶,以用于有机分子与蛋白质的期望缀合,同时避免酶的任何显著的柱流失。根据本专利技术,该目的通过使用固定和/或非固定形式的MTG(微生物转谷氨酰胺酶)使有机分子与靶蛋白质缀合并产生融合蛋白质的方法实现,其包括以下步骤:a)通过暴露聚合物的交叉反应性基团将所述MTG连接到所述聚合物以固定所述MTG;b)将所述MTG聚合物缀合 ...
【技术保护点】
1.用于使用固定和/或非固定形式的MTG(微生物转谷氨酰胺酶)使有机分子与靶蛋白质缀合并产生融合蛋白质的方法,其包括以下步骤:a)通过暴露聚合物的交叉反应性基团将所述MTG连接到所述聚合物以固定所述MTG;b)将MTG聚合物缀合物吸附在微珠上或使所述MTG聚合物缀合物成为溶液;c)用吸附有所述MTG聚合物缀合物的微珠和/或包含所述MTG聚合物缀合物的溶液和/或包含所述MTG的溶液填充活性流动反应器柱;d)在确定的条件下在流体中提供所述靶蛋白质和有机分子并使所述流体通过经填充的活性流动反应器柱或将所述流体与包含所述MTG聚合物缀合物的溶液和/或包含MTG的溶液混合,从而在所述MTG的催化作用下使所述有机分子与所述蛋白质缀合;e)从所述流体中提取蛋白质有机分子缀合物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.20 EP 16180382.01.用于使用固定和/或非固定形式的MTG(微生物转谷氨酰胺酶)使有机分子与靶蛋白质缀合并产生融合蛋白质的方法,其包括以下步骤:a)通过暴露聚合物的交叉反应性基团将所述MTG连接到所述聚合物以固定所述MTG;b)将MTG聚合物缀合物吸附在微珠上或使所述MTG聚合物缀合物成为溶液;c)用吸附有所述MTG聚合物缀合物的微珠和/或包含所述MTG聚合物缀合物的溶液和/或包含所述MTG的溶液填充活性流动反应器柱;d)在确定的条件下在流体中提供所述靶蛋白质和有机分子并使所述流体通过经填充的活性流动反应器柱或将所述流体与包含所述MTG聚合物缀合物的溶液和/或包含MTG的溶液混合,从而在所述MTG的催化作用下使所述有机分子与所述蛋白质缀合;e)从所述流体中提取蛋白质有机分子缀合物。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述聚合物经历与所述微珠的离子和/或共价结合。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述聚合物是第二代树状化聚合物(de-PG2)。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶蛋白质选自由以下组成的组:IgG、IgM、IgA或IgE形式的抗体或其片段,并且优选为单克隆的,其任选地选择为嵌合的、人源化的、人的或者双特异性的、去糖基化的或非糖基化的,其包含对残基N297的突变(例如N297Q或N297A)(EU编号方案),并且优选地还包含使得能够进行MTG介导的缀合的抗体骨架中的其他反应性谷氨酰胺残基突变。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶蛋白质是肽,例如Fab、Fab’、F(ab)’2、F(ab)’3、Dab、Fv、单链Fv(scFv)片段scFv-Fc(scFv)2,其中另外可能的蛋白质和/或肽包括参与其他蛋白质和肽之识别的蛋白质和肽,包括但不限于蛋白激酶,例如丝裂原活化蛋白(MAP)激酶,和直接或间接使MAP激酶、Januse激酶(JAKI)和细胞周期蛋白依赖性激酶磷酸化的激酶,表皮生长因子(EGF)受体,血小板衍生生长因子(PDGF)受体,成纤维细胞衍生生长因子(FGF)受体,胰岛素受体和胰岛素样生长因子(IGF),工程化蛋白质,例如darpin、亲和体/纳米体或纤连蛋白片段,或载体蛋白质,或引发免疫反应并因此对疫苗接种重要的半抗原,例如白喉毒素突变体CRM197,或GBS67(PI-2a的辅助蛋白);此外,其优选地还包括与非蛋白质结构的缀合,所述非蛋白质结构例如单或多聚右旋糖酐,例如葡聚糖。6.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述酶用有机分子修饰所述靶蛋白质上的一个或更多个反应性谷氨酰胺残基(例如抗体中的Q295和N297Q)或一个或更多个反应性赖氨酸残基(例如抗体中的K288或K290、K340);其中所述残基是内源的或通过遗传方法人工引入的或者其组合。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述有机分子选自由以下组成的组:荧光染料/标记(例如Alexa488、Alexa647),细胞的细胞毒性或影响部分,例如毒素(例如MMAE、PBD-二聚体)或细胞调节剂、免疫细胞免疫调节/刺激化合物,适于SPECT/PET或MRI的金属螯合剂(例如NODA-GA),功能性肽(例如α防御素NP-1),适于点击反应例如应变促进的叠氮化物-炔烃点击化学(SPAAC)或四嗪-烯烃连接的化学部分,包括叠氮化物和环辛炔衍生物(例如DIFO、BCN、DIBAC、DIBO、ADIBO),以及四嗪和反式环辛烯衍生物,其具有用于MTG介导的缀合的伯胺,和具有Cn>20的间隔物部分,其中(c)n优选为经取代或未经取代的烷基或杂烷基链及其衍生物(例如,链中的任何碳任选地被烷氧基、羟基或酰胺、或烷基酰胺取代),并且n是选自>20的范围的整数。8.根据前述权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述有机分子选自由以下组成的组:肽,所述肽包含在任何位置的赖氨酸(例如KNAAGGG或KDAAGGG或KAYAGGG或AKETAA)或在任何位置的谷氨酰胺残基(例如FGLQPRY、SLLQGR),并且被MTG靶向(即MTG的底物),并且任选地包含可酶促切割的肽序列(例如缬氨酸-瓜氨酸(vc),KNAAGGG-VC);所述赖氨酸肽的大小(长度)为(C+N)n>20且所述谷氨酰胺肽的大小(长度)为1<(C+N)n<200。9.根据权利要求8所述的方法,其中所述肽含...
【专利技术属性】
技术研发人员:菲利普·勒内·斯派克,马丁·贝赫,罗格·希布利,大卫·赫维茨,
申请(专利权)人:保罗·谢勒学院,
类型:发明
国别省市:瑞士,CH
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