使癌细胞对胞毒免疫细胞攻击敏感的NKG2D活化配体蛋白表达制造技术

本发明专利技术提供了表达NKG2D活化配体如UL‑16结合蛋白的重组病毒载体。当导入癌细胞中时，所述载体可以引起NKG2D活化配体的表达，从而克服NK介导的(或其他效应细胞，例如巨噬细胞)细胞毒性的抑制并导致效应细胞介导的癌细胞的死亡。NKG2D活化配体的表达可以通过在非癌细胞中以比癌细胞中更高浓度存在的miRNA来控制，这可以允许配体在癌细胞中选择性表达并且降低对非癌细胞的细胞毒性。所述载体可以引起溶瘤因子的表达。当配制成药物组合物并给予患者时，所述载体可用于治疗癌症。癌症可以是神经胶质瘤，如胶质母细胞瘤，包括具有异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变的胶质母细胞瘤。所述载体可以是单纯疱疹病毒载体等。

Expression of NKG2D Activated Ligand Protein Sensitizing Cancer Cells to Cytotoxic Immune Cell Attack

The present invention provides a recombinant virus vector expressing NKG2D activated ligands such as UL 16 binding protein. When introduced into cancer cells, the vector can induce the expression of NKG2D activating ligands, thereby overcoming the inhibition of NK-mediated cytotoxicity (or other effector cells, such as macrophages) and leading to effector cell-mediated cancer cell death. The expression of NKG2D-activated ligands can be controlled by the presence of higher concentrations of microRNAs in non-cancer cells than in cancer cells, which allows ligands to be selectively expressed in cancer cells and reduces cytotoxicity to non-cancer cells. The vector can induce the expression of oncolytic factors. When a pharmaceutical composition is prepared and given to a patient, the carrier can be used to treat cancer. Cancers can be gliomas, such as glioblastomas, including glioblastomas with mutations in isocitrate dehydrogenase (IDH). The vector can be a herpes simplex virus vector, etc.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使癌细胞对胞毒免疫细胞攻击敏感的NKG2D活化配体蛋白表达相关申请的交叉引用本申请要求美国临时专利申请62/350,095的优先权，其整体内容通过引用并入本文。关于联邦政府资助研究和开发的声明本专利技术是在国立卫生研究院授予的基金号AI175052和CA163205的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。以电子方式提交的通过引用并入的材料与本文一起提交并且通过引用整体并入本文的是计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，标识如下：2017年6月14日创建的名为“728947_ST25.TXT”的一个3,118字节的ASCII(文本)文件。
技术介绍
甲基化相关的表观遗传抑制(epigeneticrepression)与人类恶性肿瘤的发展相关。特别地，天然杀伤(NK)细胞配体的表观遗传抑制是一种与癌症发展共同进化的常见事件。用于克服NK细胞配体抑制的新技术可用于治疗癌症。国际PCT公开号WO2015/066042(通过引用整体并入本文)公开了重组溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)，其表达插入HSV复制基因座中的对细胞表面分子特异性的转基因配体和一个或多个拷贝的微RNA靶序列。溶瘤HSV和使用方法的综述在Varghese和Rabkin，CancerGeneTherapy(2002)9，967-978中得以公开，其也通过引用并入本文。
技术实现思路
本专利技术是基于以下发现：在异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变体(IDHMut)神经胶质瘤中NKG2D活化配体(NKG2DL)的转录抑制，例如与IDHMut细胞对自然杀伤(NK)细胞介导的体外和离体细胞溶解的易感性与IDH野生型(WT，IDHWT)细胞相比降低有关。本专利技术提供了表达人NKG2D配体(如UL16结合蛋白(ULBP)(例如，ULBP1-ULBP6，特别是ULBP1和ULBP3))的基于HSV的载体，在一些实施方案中，其能增强NK和T细胞对癌症细胞的识别。病毒介导的ULBP表达可导致通过NKG2D受体(NKG2DR)识别ULBP的NK细胞和/或T细胞的活化，并随后破坏靶肿瘤细胞。该策略代表了用于癌症治疗的载体介导的基因疗法的新方法。在一些实施方案中，本专利技术提供了一种包含一种或多种外源基因(例如转基因)的重组病毒载体，当所述载体被引入癌细胞时，所述外源基因表达至少一种NKG2D活化配体蛋白。所述载体可以是，例如，腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、或单纯疱疹病毒(HSV)载体。配体蛋白的表达可使癌细胞对效应细胞介导的细胞毒性(例如，NK细胞介导的细胞毒性)敏感化。所述NKG2D配体蛋白可以是UL16结合蛋白(ULBP)，如ULBP1-ULBP6、MIC-A或MIB-B中的任一种。在具体的实施方案中，ULBP是ULBP1和ULBP3中的一个或两者，以致当所述载体被引入癌细胞时，本专利技术的载体表达ULPB1、ULBP3、或者ULBP1和ULBP3两者。在一些实施方案中，NKG2D配体的表达受细胞生物分子的调节控制。在一些实施方案中，细胞生物分子在非癌性细胞中比在癌细胞中的浓度更大，以致相对于在癌细胞中的表达，NKG2D配体在非癌细胞中的表达被下调。在一些实施方案中，细胞生物分子是微RNA(miRNA或miR)。在一些实施方案中，miR是miR122、miR124、miR128、miR137和/或miR199中的一个或多个。在一些实施方案中，本文所述的载体包含插入到一个或多个病毒基因和/或一个或多个外源基因中的一个或miRNA靶序列。在一些实施方案中，所述载体包括插入到一个或多个外源基因中的2、3、4、5、6或更多个靶序列。在一些实施方案中，miR靶序列是串联的。在一些实施方案中，miR靶序列被四个或更多个核苷酸的间隔区隔开。所述一个或多个miRNA靶序列可以是miRNA的反向互补序列(reversecomplement)。在一些实施方案中，一个或多个miRNA靶序列被插入到表达NKG2D配体的一个或多个病毒基因和/或外源基因的3’非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，载体可包含削弱或阻断载体复制和/或毒性基因表达的一个或多个基因敲除、敲低、缺失、插入或者其他突变。例如，在一个非限制性的说明性实施方案中，HSV载体可以包括在ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和/或ICP47基因中的一个或多个基因中的一个或多个基因敲除、敲低、缺失、插入或其它突变。在进一步的实施方案中，HSV载体可以包括在所有ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47基因中的一个或多个基因敲除、敲低、缺失、插入或其它突变。在一些实施方案中，载体是不能复制的(replicationincompetent)(即，在非互补细胞和/或体内不复制)。在一些实施方案中，本文所述的重组病毒载体被引入到细胞中。在一些实施方案中，所述细胞可以是对效应免疫细胞的NKG2D依赖性细胞溶解敏感的任何癌细胞，包括IDHMut和IDHWT癌细胞。在一些实施方案中，所述载体包括编码至少一个NKG2D活化配体蛋白的第一外源基因和编码溶瘤因子的第二外源基因。溶瘤因子的非限制性实例包括酶(例如蛋白酶)、细胞因子、趋化因子、抗体、或其它生物活性多肽。在一些特定实施方案中，溶瘤因子是酶，如金属蛋白酶(例如基质金属蛋白酶-9(MMP-9))、前药转化酶、胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、或选自表1中列出的那些的酶。在一个实施方案中，本专利技术提供了编码本文所述任意载体的核酸。在一些实施方案中，所述核酸可以是细菌人工染色体(BAC)。在一些实施方案中，本专利技术提供了本文所述任意载体的病毒原液(viralstock)。在一些实施方案中，本专利技术提供了包含本文所述任何载体的药物组合物。在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂(carrier)。在一些实施方案中，本专利技术提供了在癌细胞中表达NKG2D配体蛋白的方法，所述方法包括将任何本文所述的载体、药物组合物或病毒原液引入癌细胞，条件是足以使所述载体感染癌细胞并表达NKG2D配体蛋白。在一些实施方案中，细胞可以源自患有癌症的受试者(例如，原代细胞样品，例如活组织检查)。在一些实施方案中，癌细胞可以是但不限于神经胶质瘤细胞，如多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞。在此类实施方案中，NKG2D配体蛋白的表达增强了癌细胞(例如，胶质母细胞瘤细胞)对NK介导的细胞毒性的易感性。在一些实施方案中，本专利技术提供了治疗有此需要的哺乳动物受试者的癌症的方法，包括向受试者施用本文所述的任何载体、药物组合物或病毒原液，从而治疗癌症。在一些实施方案中，所述载体、药物组合物或原液可以直接施用于肿瘤，例如通过瘤内注射，颅内注射(适合于肿瘤类型)或全身施用。附图说明图1表明NKG2D配体在IDHMut神经胶质瘤中差异性地表达。RNAseq分析：使用从来自286个个体弥漫性神经胶质瘤样本的TCGA数据库中可公开获得的RNASeq的数据，在IDHMut和IDHWT弥漫性胶质瘤中比较1639个免疫相关基因(GeneOntologyCategory0050776)。图1A：62个差异表达基因的无监督分级聚类(unsupervisedhierarchicalclustering)，其中p值＜1e-7且基因表达的绝对差异大于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含外源基因的重组病毒载体，当所述载体被引入癌细胞时，所述外源基因表达至少一种NKG2D活化配体蛋白，其中所述载体选自由腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体组成的病毒载体的组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.14 US 62/350,0951.包含外源基因的重组病毒载体，当所述载体被引入癌细胞时，所述外源基因表达至少一种NKG2D活化配体蛋白，其中所述载体选自由腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体组成的病毒载体的组。2.权利要求1的载体，其中，所述配体蛋白的表达使所述癌细胞对NK介导的细胞毒性敏感。3.权利要求1的载体，其中，所述NKG2D配体蛋白是UL16结合蛋白(ULBP)。4.权利要求3的载体，其中，所述NKG2D配体蛋白是选自由ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5或ULBP6组成的ULBP的组的一个或多个ULBP。5.权利要求3的载体，其中，所述NKG2D配体蛋白具有ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5或ULBP6之一或与ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5或ULBP16之一的氨基酸序列具有至少95％同一性的蛋白的氨基酸序列。6.权利要求1的载体，其中，当所述载体被引入癌细胞时，载体表达ULBP1、ULBP3、或ULBP1和ULBP3两者。7.上述权利要求中任一项的载体，其中，所述NKG2D配体的表达被置于细胞生物分子的调节控制之下。8.权利要求7的载体，其中，所述细胞生物分子是在非癌细胞中以比在所述癌细胞中更高的浓度出现的细胞生物分子，并且相对于在所述癌细胞中的表达，所述NKG2D配体的表达在非癌细胞中下调。9.权利要求8的载体，其中，所述细胞生物分子是miRNA。10.权利要求9的载体，其中，所述载体包含一个或多个miRNA靶序列，并且任选地包含2、3、4、5或6个靶序列，所述靶序列任选地串联，并且任选地由四个或更多个核苷酸的间隔区隔开。11.权利要求10的载体，其中，所述一个或多个miRNA靶序列包含所述miRNA的反向互补序列。12.权利要求9-11中任一项的载体，其中，所述miRNA包括mir122、mir124、mir128、mir137和/或mir199。13.权利要求9-12中任一项的载体，其中，将所述一个或多个miRNA靶序列插入到表达所述NKG2D配体的所述外源基因的3′UTR中。14.上述权利要求中任一项的载体，进一步包括削弱或阻断所述载体复制和/或毒性基因表达的一个或多个基因敲除、敲低、缺失、插入或者其他突变。15.权利要求14的载...

【专利技术属性】
技术研发人员：宝拉·格兰迪，尼杜卡库·梅格贝钦耶尔·阿曼库乐，约瑟夫·C·格洛廖索三世，
申请(专利权)人：匹兹堡大学属高等教育联邦体系，
类型：发明
国别省市：美国,US