预防蛋白质二硫键还原制造技术

本文披露了用于在含二硫键蛋白质的制造工艺期间测试谷胱甘肽系统组分和硫氧还蛋白系统组分的存在和/或活性的方法。还披露了用于减少制造工艺期间二硫键还原和降低含二硫键蛋白质的还原电位的方法。本文提供了用于在蛋白质制造工艺期间减少含二硫键蛋白质的还原并降低其还原电位的组合物、试剂盒和方法。

Preventing protein disulfide bond reduction

A method for testing the presence and/or activity of glutathione system components and thioredoxin system components during the manufacturing process of disulfide bonded proteins is disclosed. A method for reducing the reduction potential of disulfide bonds and proteins containing disulfide bonds during the manufacturing process is also disclosed. Compositions, kits and methods for reducing the reduction potential of disulfide bonded proteins during protein manufacturing are provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】预防蛋白质二硫键还原
本披露涉及单克隆抗体和所得产物变体的还原。本文披露了用于增加含完整二硫键的蛋白质产量的方法、用于减少含二硫键蛋白质的还原的方法、以及用于减少含二硫键蛋白质的还原电位的方法。
技术介绍
单克隆抗体(mAb)能够以高亲和力和异常的特异性结合多种靶标。因此，已成功设计mAb以治疗多种疾病和病症，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病和炎症、心血管疾病和眼科疾病。临床上mAb的高成功率使其成为一类快速发展且日益重要的治疗方法。为了满足对这些救命分子日益增长的需求，已经投入大量精力来开发被设计用于增加抗体滴度同时保持一致产品质量的mAb的制造工艺。在过去的十年中，抗体滴度已经实现快速增加，目前的制造工艺产生大于10g/L的mAb。许多蛋白质分子仅在形成稳定的分子间和分子内二硫键的情况下起作用，以正确地折叠和维持功能。这些蛋白质分子的实例是免疫球蛋白和含有免疫球蛋白结构域的细胞表面受体、核糖核酸酶、乳白蛋白、胰岛素、角蛋白、血球凝集素、病毒膜蛋白、神经内分泌蛋白7B2、表皮生长因子、雄性腺体激素、AP-1样转录因子YAP1、乙酰胆碱受体、树眼镜蛇毒素、骨形态发生蛋白2-A、绒毛膜促性腺激素、组蛋白H3、血小板反应蛋白1、disintegrinschistatin、snaclecbotrocetin、乙酰胆碱酯酶胶原蛋白尾肽、蓝豆蛋白δ-2、氧化还原酶、硫化物脱氢酶和溶菌酶。标准抗体分子包括四条肽链，即两条重链和两条轻链。通过在四条链之间形成二硫键，这四条肽链在功能性抗体分子中正确地折叠在一起。抗体分子的肽链内形成的二硫键的数量根据抗体亚型而变化。在制造期间可以发生含内部锚定二硫键蛋白质的二硫键的还原。早在2010年就针对制造免疫球蛋白报道了这个问题，并随后在整个行业范围内被观察到(Hutterer等人，2013,mAbs,5:608–613；和Kao等人，2010,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程],107:622–632)。链间二硫键的还原导致功能性抗体的丧失，并且需要更复杂的纯化过程以去除无活性的副产物(Mun等人，2014,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程],112(4):734-742)。在mAb工艺开发期间，必须将片段和聚集体去除至足够的水平，因为它们具有与增加的免疫原性相关的风险和对药物功效的未知影响。此外，这些杂质的存在还会影响产品在储存期间的稳定性，导致保质期缩短。蛋白质或多肽的片段化可能由产物不稳定性(CordobaA.等人，2005,J.Chrom.B.[色谱法杂志B卷],818(2):115-21)或通过细胞中存在的宿主细胞蛋白(HCP)的蛋白水解活性(Gao等人，2011,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程]108(4):977-982)引起，而聚集可以在制造工艺期间和之后的各个步骤(例如在细胞培养、收获、纯化、冻融、装瓶(vialing)和储存期间)发生。通常在工艺开发期间实施策略，以改善这两种产品质量属性。这些包括：优化生物反应器条件以防止细胞培养期间的片段化或聚集体形成；优化收获条件以使细胞裂解最少化(HutchinsonN.等人，2006,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程],95(3):483-491)；在纯化过程(例如离子交换、疏水相互作用和混合模式)中结合色谱抛光(polishing)步骤以从目的产物中分离杂质；和配制品开发过程中的赋形剂筛选，以使分子保质期期间的聚集和片段化最少化。各种策略已经被用于减少制造工艺期间的抗体还原，这些策略包括冷却、提供氧化性存储环境、保持持续更短的时间段、和添加至少一种还原抑制剂。以前的报告将细胞培养蛋白质制造工艺中经历的还原仅归因于硫氧还蛋白系统。这些研究使用针对硫氧还蛋白系统的一定浓度的抑制剂，在这些浓度下这些抑制剂不再对硫氧还蛋白系统具有特异性(Kao等人，2010,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程],107:622–632；Kao等人，2013,美国专利号8,574,869)。通过使用针对硫氧还蛋白系统的一定浓度的抑制剂(在这些浓度下这些抑制剂不再对硫氧还蛋白系统具有特异性)，Kao等人将细胞培养制造工艺中经历的还原仅归因于硫氧还蛋白系统，并评论了谷胱甘肽还原酶系统在抗体还原中缺乏作用。因此，有必要避免含二硫键蛋白质的制造或储存期间的二硫键还原。避免制造期间含二硫键蛋白质的还原可以提高整个保质期内完整蛋白质的稳定性。因此，需要开发含二硫键蛋白质的制造工艺，该工艺可避免二硫键的还原并导致整个保质期内完整蛋白质的稳定性增加。
技术实现思路
本专利技术涉及用于防止含二硫键蛋白质的二硫键还原以增加整个保质期内完整蛋白质的稳定性的方法。该方法通过减少含二硫键蛋白质的还原或通过减少制造工艺期间含二硫键蛋白质的还原电位来改善纯化的含二硫键蛋白质的稳定性。在实施例中，本披露涉及用于提高细胞培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质产量的方法，该方法包括在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂、或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂两者的存在下制造含二硫键的目的蛋白质，由此，在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量更高。在某些实施例中，本披露涉及用于在制造工艺中提高含完整二硫键的目的蛋白质的产率的方法，该方法包括：检测包含含二硫键的目的蛋白质的培养物和/或溶液中谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的存在，并添加谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶抑制剂以减少含二硫键的目的蛋白质的还原。在某些实施例中，本披露涉及还包括测定所检测的谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的活性的方法。在另外的实施例中，测定谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的活性包括：向在制造工艺期间得到的样品中添加5,5'-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；将硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种添加到含有DTNB的样品的一部分中；和监测该样品中波长412nm处的DTNB的还原；其中，在没有硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种的情况下，该样品中DTNB的较高还原指示硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶的活性。在某些实施例中，在监测还原之前将NADPH、氧化型谷胱甘肽和缓冲液添加到样品中。在实施例中，本披露涉及通过在过程期间将细胞外胱氨酸水平维持在0之上来提高细胞培养或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低含二硫化物的目的蛋白质的还原电位的方法。在某些方面，将完整的目的蛋白质释放到细胞培养液(CCF)中。在某些方面，该过程包括将这些细胞维持在CCF中持续至少2天、至少8天、至少10天、至少12天、至少14天或至少16天。在本披露的某些方面，该细胞培养过程是哺乳动物或昆虫细胞培养过程，并且该发酵过程是细菌、酵母或真菌发酵过程。在所披露方法的某些方面，将细胞培养或发酵过程中的胱氨酸水平维持在0之上，以防止二硫键还原。在某些方面，在所披露的方法中，相对于有效量的胱氨酸在CCF中未维持在0之上的过程，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于提高细胞培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质产量的方法，该方法包括在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂两者的存在下制造该含二硫键的目的蛋白质，由此，与不是在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂、或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量相比，在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量更高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.10 US 62/3341361.一种用于提高细胞培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质产量的方法，该方法包括在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂两者的存在下制造该含二硫键的目的蛋白质，由此，与不是在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂、或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量相比，在谷胱甘肽还原酶抑制剂、硫氧还蛋白还原酶抑制剂或谷胱甘肽还原酶抑制剂和硫氧还蛋白还原酶抑制剂的存在下制造的细胞培养物或溶液中的含完整二硫键的蛋白质的量更高。2.如权利要求1所述的方法，其中通过在线测量细胞培养物氧化还原电位来控制增加细胞培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质的产量。3.如权利要求1所述的方法，其中通过测量细胞培养物氧化还原电位在线监测细胞培养物或溶液中含完整二硫键的目的蛋白质的产量的增加。4.如权利要求1所述的方法，还包括：检测包含该含二硫键的目的蛋白质的该培养物和/或该溶液中谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶的存在，并添加谷胱甘肽还原酶和/或硫氧还蛋白还原酶抑制剂以减少该含二硫键的目的蛋白质的还原。5.如权利要求4所述的方法，该方法还包括测定该谷胱甘肽还原酶和/或该硫氧还蛋白还原酶的活性。6.如权利要求5所述的方法，其中测定该谷胱甘肽还原酶和/或该硫氧还蛋白还原酶的活性包括：向在制造工艺期间得到的样品中添加5,5'-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；将硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种添加到含有DTNB的样品的一部分中；并且监测该样品中波长412nm处的DTNB的还原；其中，在没有硫氧还蛋白还原酶抑制剂和谷胱甘肽还原酶抑制剂中的至少一种的情况下，该样品中DTNB的较高还原指示硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶的活性。7.如权利要求6所述的方法，其中在监测还原之前将NADPH、氧化型谷胱甘肽和缓冲液添加到该样品中。8.一种用于提高细胞培养或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低该含二硫化物的目的蛋白质的还原电位的方法，该方法包括将细胞外胱氨酸水平维持在0之上和/或将细胞外Cu水平维持在0之上和/或在该细胞培养或发酵过程期间将EDTA添加到生物反应器中。9.一种用于提高细胞培养或发酵过程中含完整二硫键的目的蛋白质的产量或降低该含二硫化物的目的蛋白质的还原电位的方法，该方法包括将细胞外胱氨酸水平维持在0之上和/或将细胞外Cu水平维持在0之上和/或将EDTA添加到包含该含二硫键的目的蛋白质的溶液中。10.如权利要求8或9所述的方法，其中将该含完整二硫键的目的蛋白质释放到细胞培养液(CCF)中。11.如权利要求10所述的方法，其中该细胞培养或...

【专利技术属性】
技术研发人员：S阿赫加，WK钟，DS戈德伯格，M汉罗藤，S纳朗，B拉塞尔，M朱，S赫达克，K黄，J王，
申请(专利权)人：免疫医疗有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US