一种检测沙门氏菌的引物组、用途、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于细菌检测技术领域，具体涉及一种沙门氏菌的引物组、该引物组的用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法。引物组包括外引物、内引物和探针，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，探针为HP，F3、B3、FIP、BIP和BP的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示，BIP为5’生物素标记的核苷酸序列，HP为5’异硫氰酸荧光素标记的核苷酸序列。本发明专利技术的优点在于，本发明专利技术提供的引物组特异性好，利用该引物组制备的试剂盒及其检测方法特异性好、灵敏度高、成本低，不需要PCR仪等昂贵设备，肉眼可判断结果，准确特异性的检测沙门氏菌，可应用于基层或野外实时、快速、准确检测沙门氏菌。

A Primer Group, Use, Kit and Detection Method for Salmonella Detection

The invention belongs to the technical field of bacterial detection, in particular to a primer group of Salmonella, the use of the primer group, a kit containing the primer group and a detection method thereof. The primers group consisted of external primers, internal primers and probes. The external primers were F3 and B3, the internal primers were FIP and BIP. The nucleotide sequences of HP, F3, B3, FIP, BIP and BP were shown as SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5, BIP was 5'biotin-labeled nucleotide sequence and HP was 5' isothiocyanate-labeled nucleotide sequence. The advantages of the invention are that the primer group provided by the invention has good specificity, the kit prepared by the primer group and its detection method have good specificity, high sensitivity, low cost, and does not need expensive equipment such as a PCR instrument. The results can be judged by naked eyes, and the accurate and specific detection of Salmonella can be applied to real-time, rapid and accurate detection of Salmonella at grass-roots or in the field.

【技术实现步骤摘要】
一种检测沙门氏菌的引物组、用途、试剂盒及其检测方法
本专利技术属于细菌检测
，具体涉及一种检测沙门氏菌的引物组，同时涉及该引物组的用途、利用该引物组制备的试剂盒及该使用试剂盒检测沙门氏菌的检测方法。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonellaspp.)是一大群寄生于人类和动物肠道内的革兰氏阴性杆菌(G-)，是肠杆菌科中最常见的人畜共患型致病菌。目前已知的沙门氏菌血清型超过2500种，除了不到10种罕见的血清型属于邦戈尔沙门氏菌外，其余血清型都属于肠道沙门氏菌，因此几乎所有的沙门氏菌都能引起严重的食物中毒事件。入侵作用是沙门氏菌进入机体，引起机体患病主要的关键因素，有毒力的沙门氏菌能入侵小肠粘膜上皮细胞，并穿越细胞层进入血液体循环。世界卫生组织(WTO)将沙门氏菌列入具有严重危害和中等危害的食物传播性病原菌。据统计，目前世界上54％的食源性致病是由沙门氏菌引起的，位居于前列，并且在过去16年由沙门氏菌引起发病率从未降低。然而，引起沙门氏菌中毒的食品中，约90％是肉、蛋、奶等畜产品，是人们生活中极为常见并且必需的食品，由此可见，沙门氏菌的污染严重影响着人们的生活。目前，对沙门氏菌的检测主要是以传统的细菌分离、血清型实验和生化鉴定等方法为主，通常需要5-7天的检测周期，存在操作繁琐、灵敏度低、准确率不高且需要的试剂多且杂等缺陷，不能满足对食品及时有效的质量监测和疾病控制的需求。同时，市面上也存在灵敏度更高的检测方法，如常规PCR检测技术，该方法也是检测机体或食物中沙门氏菌最常用的方法，但是该方法存在特异性低的缺陷，复杂样品中的某些成分对PCR扩增存在抑制作用，扩增时容易产生假阳性。由于PCR检测需要依赖PCR仪器或荧光PCR仪、这些都是比较昂贵的器材，通常仅设置在医院或实验室中，一般的检测基站无法配置；并且PCR检测技术使用试剂多而且杂，同时还需要复杂繁琐的电泳过程；此外，使用PCR检测技术还需要经过专业培训的人员进行操作，防止因个人操作影响检测结果。基于上述使用缺陷，PCR检测技术在沙门氏菌的检测工作中，很难得到普遍应用。另外，食物中的沙门氏菌浓度较低，往往容易导致产生漏检，但食物中的低浓度沙门氏菌也足以引起机体患病，因此，开发一种灵敏度高、检测周期短的检测方法迫在眉睫。因此急待开发精确、灵敏、快速、无污染的病原微生物检验方法。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种检测成本低的检测沙门氏菌的引物组，同时涉及该引物组的用途、利用该引物组制备的试剂盒及该使用试剂盒检测沙门氏菌的检测方法。基于此，本专利技术所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种检测肠道沙门氏菌的引物组，所述引物组包括外引物、内引物和探针，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，探针为HP，所述F3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述BIP为5’生物素(biotin)标记的核苷酸序列，所述HP的序列如SEQIDNO.5所示，HP序列为5’异硫氰酸荧光素标记的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种检测沙门氏菌的试剂盒，包括前述引物组、LAMP扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为沙门氏菌标准株基因组DNA(ATCC13076)，所述阴性质控品为双蒸水。具体的，上述检测沙门氏菌的试剂盒，所述LAMP扩增试剂包括浓度为10×的IsothermalAmplificationBuffer、浓度为8000U/mL的Bst2.0WarmStartDNA聚合酶、浓度为10mmol/L的dNTPsMIX和浓度为100mmol/L的MgSO4。具体的，上述检测沙门氏菌的试剂盒，所述浓度为10×的IsothermalAmplificationBuffer中包含浓度为200的mmol/LTris-HCl、浓度为100mmol/L的(NH4)2SO4、浓度为500mmol/L的KCl、浓度为20mmol/L的MgSO4和体积百分数为0.1％的Tween20，所述IsothermalAmplificationBuffer的pH为8.8。具体的，上述检测沙门氏菌的试剂盒，还包括横向流动试纸条或SYBRGreenI荧光染料。本专利技术还提供了一种用前述试剂盒检测沙门氏菌的检测方法，包括以下步骤：(1)准备待测DNA样品：按常规DNA提取方法提取待测样本的DNA；(2)配制三组LAMP的反应液：包括检测组、阴性对照组和阳性对照组，三组LAMP的反应液中均包括LAMP扩增试剂、前述的引物组、模板和双蒸水，所述检测组、阳性对照组和阴性对照组的模板分别依次为待测DNA样品、阳性质控品和双蒸水；(3)扩增反应：将步骤(2)中配制好的三组LAMP反应液分别混匀离心，进行扩增，分别得到三组LAMP反应液；(4)检测：将三组LAMP反应液分别检测，判断结果。具体的，上述检测沙门氏菌的检测方法，所述步骤(3)中扩增反应的反应条件为，65℃恒温反应40min。具体的，上述检测沙门氏菌的检测方法，所述步骤(2)中PCR反应液的体积为25μL；每组PCR反应液中各组分的加样量为：10×的IsothermalAmplificationBuffer为2.5μL，100mmol/L的MgSO4为1μL，10mmol/L的dNTPsMIX为3μL，8000U/mL的Bst2.0WarmStartDNA聚合酶为1μL，10μmol/L的F3和B3各为0.5μL，10μmol/L的FIP和BIP各为4μL，模板为2μL，余量用双蒸水补齐。本专利技术还提供了一种前述引物组在检测沙门氏菌或制备检测沙门氏菌的试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的检测沙门氏菌的引物组特异性好，利用该引物组制备的试剂盒和利用该试剂盒的检测沙门氏菌的检测方法特异性好、灵敏度高、成本低，不需要PCR仪等昂贵设备，肉眼可判断结果，准确特异性的检测沙门氏菌，可应用于基层、野外或各个关卡等实时、快速和准确检测沙门氏菌。附图说明图1是本专利技术中的检测沙门氏菌的引物组的特异性检测结果图；图2是本专利技术的试验例6中本专利技术提供的试剂盒的特异性检测结果图；图3是本专利技术的试验例7中本专利技术提供的试剂盒的灵敏度的检测结果图。具体实施方式下面结合附图及具体试验例对本专利技术做进一步阐释。试验例1本试验例的目的在于提供用于检测沙门氏菌的两对特异性引物。依据NCBI上公开的沙门氏菌的基因组序列(GenBankaccessionnumberU25352)，根据引物设计原则和LAMP扩增技术原理设计两对引物，包括外引物、内引物和探针，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，探针为HP，所述F3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，BIP为5’生物素(biotin)标记的序列，所述HP的序列如SEQIDNO.5所示，HP序列为5’异硫氰酸荧光素标记的序列。将设计的两对特异性引物及探针送至生物公司合成，分别得到F3/B3/FIP/BIP/HP，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测沙门氏菌的引物组，其特征在于：所述引物组包括外引物、内引物和探针，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，探针为HP，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述BIP为5’生物素标记的核苷酸序列，所述HP的序列如SEQ ID NO.5所示，所述HP序列为5’异硫氰酸荧光素标记的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测沙门氏菌的引物组，其特征在于：所述引物组包括外引物、内引物和探针，其中外引物为F3和B3，内引物为FIP和BIP，探针为HP，所述F3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述BIP为5’生物素标记的核苷酸序列，所述HP的序列如SEQIDNO.5所示，所述HP序列为5’异硫氰酸荧光素标记的核苷酸序列。2.一种检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组、LAMP扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为沙门氏菌标准株基因组DNA，所述阴性质控品为双蒸水。3.根据权利要求2所述的检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述LAMP扩增试剂包括浓度为10×的IsothermalAmplificationBuffer、浓度为8000U/mL的Bst2.0WarmStartDNA聚合酶、浓度为10mmol/L的dNTPsMIX和浓度为100mmol/L的MgSO4。4.根据权利要求3所述的检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述浓度为10×的IsothermalAmplificationBuffer中包含浓度为200mmol/L的Tris-HCl、浓度为100mmol/L的(NH4)2SO4、浓度为500mmol/L的KCl、浓度为20mmol/L的MgSO4和体积百分数为0.1％的Tween20，所述IsothermalAmplificationBuffer的pH为8.8。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红宁，梅雪然，翟熙雯，雷昌伟，叶晓兰，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51