一种可直接注射应用的细胞制剂及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种可直接注射应用的细胞制剂及其制备方法。本发明专利技术所述的细胞制剂，包括脐带间充质干细胞、成纤维细胞、胎盘干细胞、脂肪干细胞、NK细胞、CIK细胞、DC细胞等，经过各种成分溶液处理，使制成的细胞制剂生物活性高且适用于人体注射。

A cell preparation for direct injection and its preparation method

The invention provides a cell preparation which can be directly injected and applied and a preparation method thereof. The cell preparation of the invention includes umbilical cord mesenchymal stem cells, fibroblasts, placental stem cells, adipose stem cells, NK cells, CIK cells, DC cells, etc. After being treated with various component solutions, the prepared cell preparation has high biological activity and is suitable for human injection.

【技术实现步骤摘要】
一种可直接注射应用的细胞制剂及其制备方法
本专利技术涉及一种可直接注射应用，且细胞活性高的细胞制剂。其中涉及脐带间充质干细胞、胎盘干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、NK细胞、CIK细胞、DC细胞等的培养方法及其细胞制剂的制备。
技术介绍
用于临床应用的细胞制剂主要可分为贴壁细胞制剂和悬浮细胞制剂两大类。贴壁细胞制剂大多使用脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞、成纤维细胞等。贴壁细胞在集体发育和器官组织更新中发挥重要作用。其中脐带间充质干细胞，可获取的细胞数量多、活力强，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题，是最具临床应用前景的多能干细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。而且随着研究的开展，干细胞可用于肝衰竭、心血管疾病、不孕不育、脊髓损伤、神经退行性等多种疾病。悬浮细胞制剂主要有NK细胞、CIK细胞、DC细胞等。NK细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生；DC细胞是目前已知体内递呈功能最强的抗原提呈细胞，经体外大量扩增培养、肿瘤抗原致敏后，回输给患者，可促使患者的T细胞增殖分化为细胞毒性T细胞、同时激活B淋巴细胞，全面启动抗体免疫系统产生高效而特异的抗肿瘤效应；CIK细胞由细胞因子在体外诱导并大量扩增具有杀伤肿瘤活性的细胞，具有强大的抗瘤活性和非限制性杀瘤的优点，可用于任何一期的肿瘤患者。这种细胞对肿瘤细胞的精确识别杀伤能力很强。免疫细胞的应用在于对手术后或放化疗后的患者治疗，它能消除残留微小的转移病灶，防止肿瘤细胞扩散和复发，并能提高机体免疫力。细胞应用于人体的途径有注射输注、局部注射、介入给予细胞等方式，注射输注这种方式因其操作简单、调节全身，免疫状态效果好等优点成为比较常用的方法。临床细胞应用一个疗程通常需要输注多次，每次输注时间由专家结合各方面情况给出。由于细胞培养基中都含有很多不明确的物质会影响细胞的使用。细胞离开培养环境后会处在饥饿状态，这时细胞会分解一定量的蛋白来维持代谢。而且用于人体注射需要保证细胞制品生产中的样品与终产品的质量。需细胞特性分析、功能性分析、纯度分析和安全性等方面确保无质量问题，并且根据制品的自身特性可再增加其他相关的研究项目。细胞特性鉴定包括细胞基因型、表型鉴定、分化潜能、表面标志物的表达、生化活性、对外源性刺激的应答和表达产物的定性与定量的鉴定等方面。所以注射应用的细胞制剂需解决以上关键问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可注射用细胞制剂。本专利技术所述的细胞制剂是用生理盐水等对细胞进行处理后，用A液，B液对细胞进行处理，使细胞不会呈现在饥饿状态下，并且可以直接用于人体注射用。本专利技术所用生理盐水或葡萄糖溶液等等渗溶液是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液或葡萄糖溶液等。采用生理盐水是指质量分数为0.9％的氯化钠注射溶液或5％的葡萄糖溶液，其与人体组织的渗透压一致，以其作溶剂，不会对脐带间充质干细胞、胎盘干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、NK细胞、CIK细胞、DC细胞等产生损伤。本专利技术所用人血白蛋白是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40％～60％。能够维持血浆胶体渗透压的恒定且承担一定的运输功能。也有报道证实在细胞制剂中添加白蛋白可以为细胞提供营养提高细胞在制剂中的存活率，且细胞制剂在低温保藏一个月后都未见分化的迹象。在一定范围内，白蛋白的添加量与细胞的存活率成正相关。但过高的白蛋白浓度会导致细胞因渗透压失衡而失水变形，反而降低细胞的存活率。细胞制成细胞制剂，用于临床应用需经过以下测定(1)细胞鉴别通过细胞形态、遗传学、表面标志物或特定基因表达产物等检测，对不同供体及不同类型的细胞进行综合的细胞鉴别。(2)存活率及生长活性采用不同的细胞生物学活性检测方法，如活细胞计数、细胞倍增时间、细胞周期判断细胞活性及生长状况。(3)纯度和均一性通过检测细胞表面标志物等对制剂进行细胞纯度或均一性的检测。(4)异常免疫学反应检测异体来源细胞制剂对人总淋巴细胞增殖和对不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响，或对相关细胞因子分泌的影响，以检测细胞制剂可能引起的异常免疫反应。(5)致瘤性对于异体来源的细胞制剂或经体外复杂操作的自体细胞制剂，须通过免疫缺陷动物体内致瘤试验，检验细胞的致瘤性。(6)生物学效力试验可通过检测细胞分化潜能、诱导分化细胞的结构和生理功能、对免疫细胞的调节能力、分泌特定细胞因子、表达特定基因和蛋白等功能，判断细胞制剂与治疗相关的生物学有效性。对间充质细胞，无论何种来源，应进行体外多种类型细胞分化能力的检测，以判断其细胞分化的多能性。细胞经检测合格后方可用于细胞制剂的制备。可直接应用于人体注射的细胞制剂，需在制备时依据现行版《中华人民共和国药典》中的生物制品无菌试验和支原体检测规程，对细菌、真菌及支原体污染进行检测。依据现行版《中华人民共和国药典》中的内毒素检测规程，对内毒素进行检测。最后菌检结果、操作步骤的复核和标签核对等无误后可应用于人体注射或局部注射。贴壁细胞制剂的制备方法为培养所述的脐带间充质干细胞、胎盘干细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞等至所需代数；消化收集细胞后用生理盐水清洗；将细胞与A、B液混合均匀，制成细胞悬液，制成脐带间充质干细胞制剂、胎盘干细胞制剂、脂肪干细胞制剂、成纤维细胞制剂等。悬浮细胞制剂的制备方法为培养所述的NK细胞、CIK细胞、DC细胞等悬浮细胞；离心收集细胞，用生理盐水清洗；将细胞与A、B液混合均匀，制成细胞悬液，制成NK细胞制剂、CIK细胞制剂、DC细胞制剂等。以上细胞制剂可根据实际应用选择合适的细胞密度进行人体注射或局部注射。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1采用组织块培养的方法获得脐带间充质干细胞。培养获得原代细胞，进行传代培养。以0.5～1.2×106/ml的数量铺于175cm2的培养瓶中培养至第四代，隔天换液检测。激活细胞，获得激活的间充质干细胞后用生理盐水清洗，将细胞与A、B液混合均匀，制成细胞悬液，制成脐带间充质干细胞制剂。完成操作后对最终产品进行质量核准，如免疫原性。包括鉴别、效价、纯度、杂质、活细胞数、细胞存活率和检测无细菌、真菌、支原体、内毒素、外观、pH、渗透压、颗粒物控制等，以及操作步骤的复核和标签核对等。无误后可直接应用于人体人体注射。实施例2采用组织块培养的方法获得成纤维细胞。培养获得原代细胞，进行传代培养。以0.9～1.5×106/ml的数量铺于175cm2的培养瓶中培养至第三代，隔天换液检测。激活细胞，获得激活的成纤维细胞后用生理盐水清洗，激活细胞，获得激活的成纤维细胞后用生理盐水清洗，将细胞与A、B液混合均匀，制成细胞悬液，制成成纤维细胞制剂。完成操作后对最终产品进行质量核准，如细胞形态、活细胞数、细胞存活率、颜色、浊度、颗粒物、可见异物、无细菌、真菌等，以及操作步骤的复核和标签核对等。无误后可根据应用要求选择合适的剂量及注射器用于人体的局部注射。实施例3把各种细胞制剂存放在4℃或在4℃条件下的模拟运输，并在0h、6h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂包括A液、B液和C组分。

【技术特征摘要】
1.一种细胞制剂，其特征在于，所述的细胞制剂包括A液、B液和C组分。2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，A液为等渗溶液，如0.9％氯化钠注射液、葡萄糖溶液等。3.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，B液包括人血白蛋白、甘露醇、氨基酸、电解质、微量元素、维生素、注射用卵磷脂等营养物质。4.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，所述的C组分为脐带间充质干细胞、胎盘干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、NK细胞、CIK细胞、DC细胞等中的一种。5.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，所述的一种激活的贴壁细胞制剂的制备方法：其步骤为：a)培养权利要求1所述的脐带间充质干细胞、胎盘干细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞等至所需代数；b)消化收集步骤a中的细胞，用生理盐水清洗；c)将细胞与A、B液混合均匀，制成细胞悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏黎明，王亮，万阳，
申请(专利权)人：广州益养生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44