高效的细胞无血清培养基体系及其细胞分泌物的应用制造技术

本发明专利技术公开了高效的细胞无血清培养基体系及其细胞分泌物的应用，细胞完全培养基由基础培养基、血清替代物和补充剂组成。本发明专利技术一些实例的细胞培养基，用于人脐带来源干细胞培养时，P0细胞爬出至细胞达到传代密度所用时间只需要10天，培养得到的P4代脐带间充质干细胞呈有规律的长梭形排列，状态更好。培养得到的P4代脐带间充质干细胞依然保持了良好的分化能力，可以很好地分化为成骨细胞、成脂细胞。流式表面标志物检测则证明细胞具有干细胞的特异性表面标志物及不存在脐血干细胞的特异性表面标志物。本发明专利技术一些实例的细胞培养基，用于成纤维细胞培养时，具有更佳的生长速率，细胞的衰老程度更低，效果好于已有的商用细胞培养基。养基。

【技术实现步骤摘要】
高效的细胞无血清培养基体系及其细胞分泌物的应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体涉及高效的细胞无血清培养基体系及其细胞分泌物的应用。

技术介绍

[0002]干细胞，是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞及组织，具有免疫调节、再生修复等生物学功能。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，在体内或体外特定的诱导条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉及神经细胞等，且具有促进组织修复、免疫调节和支持造血的功能，免疫原性低，所以MSCs是再生医学和免疫调节治疗最具应用前景的组织工程种子细胞。
[0003]间充质干细胞相对于其他干细胞，其来源广泛，目前已经从骨髓、脂肪、肌肉、心脏、脐带血、脐带、胎盘等组织中相应找到。脐带干细胞、脐血干细胞、脂肪细胞、表皮细胞和成纤维细胞等可以分泌多种细胞因子、外泌体、活性蛋白等，这些细胞培养产物在抗衰老、美容、细胞修复等方面具有丰富的应用。对细胞进行培养是获得足够量的干细胞及细胞分泌物的前提，而细胞培养基是细胞培养的关键。
[0004]为了获得更好的培养效果，往往需要在基础培养基添加血清等天然成分。然而血清等的加入，可能引入病毒等外源成分，批间的细胞质量难以控制，同时成本也居高不下，限制了其使用。在细胞基础培养基中添加血清替换物对细胞进行培养，越来越受到人们的欢迎。然而这种培养基往往因为缺乏某些未知的特定营养成分，培养效果欠佳。
[0005]目前细胞培养基的种类繁多，细胞培养方式也较多，培养基的使用依不同的培养基种类、培养方式、细胞种类的不同而存在差异。无血清培养基和含10～15%血清的培养基是目前应用最广泛的培养基体系，无血清培养基优点在于无动物源组分，可减少异源物质带来的病毒、细菌等污染，安全性较高，但其缺点在于价格相对较高，适用面较低，通常只针对某一类细胞；含血清培养基，优点在于价格适中，应用广泛，适用于大部分细胞系，缺点在于安全性较无血清低，血清组分复杂，支原体、衣原体、病毒、特异性蛋白等均增加其质控难度。
[0006]F12、DMEM（低糖）、DMEM（高糖）是细胞培养常用的基础培养基，其能够满足细胞生长的基本需要，但是不能完全满足细胞增殖的需要，传代培养时细胞易于退化或老化。
[0007]市面上也存在大量的血清替代物，用于代替血清添加在基础培养基中。不同公司出品的血清替代物各有其特色，针对不同的细胞有不同的培养效果。代表性的血清替代物有Pall公司生产的Ultroser G、GIBCO公司生产的KnockOut Serum Replacement(KnockOut SR)。然而实际应用中，还是存在细胞增殖慢等不足。其使用成本也相对较高。
[0008]现有的商品化培养基种类繁多，但是根据厂商提供的使用说明，一般需要配合同一厂家其他型号的培养基才能获得较好的培养效果。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于克服现有技术中的至少一个不足，提供高效的细胞无血清培养基体系及其细胞分泌物的应用。
[0010]本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种细胞完全培养基，由基础培养基、血清替代物和补充剂组成，其中：基础培养基的用量为50～80体积份，选自MEM、F12、低糖DMEM、高糖DMEM中的至少一种；血清替代物的用量为5～50体积份，选自KnockOut
TM DMEM、Ultra CULTURE
TM Serum
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free medium、EliteGro
TM 、EliteGro
TM
‑
Adv、Ultroser
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G中的至少一种；补充剂的用量为0～5体积份，选自PEN STREP GLUTAMINE、Penicillin
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Streptomycin、Sodium Pyruvate、L
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GlutaMax中的至少一种。补充剂的作用在于提供一定的非必需氨基酸和除葡萄糖外的能量源或抑制微生物的抗生素。
[0011]为了保证产品质量的均一性，可以购买质量更为稳定的商品化培养基、血清替代物、补充剂。当年，在可以保证产品质量的情况下，也可以自行配置。
[0012]在一些实例中，血清替代物的用量为15～35体积份。
[0013]在一些实例中，补充剂的用量为0.5～4体积份。
[0014]在一些实例中，所述细胞完全培养基的组成为：基础培养基65体积份、血清替代物33体积份、补充剂2体积份，其中：基础培养基为DMEM basic(1X)（高糖）；血清替代物为KnockOut
TM DMEM(1X)；补充剂为PEN STREP GLUTAMINE。
[0015]在一些实例中，所述细胞完全培养基的组成为：基础培养基75体积份、血清替代物24体积份、补充剂1体积份，其中：基础培养基为DMEM/F12；血清替代物为Ultra CULTURETM Serum
‑
free medium；补充剂为GlutaMax
™
。
[0016]本专利技术的第二个方面，提供：一种细胞培养方法，包括将细胞接种于细胞完全培养基内并及时更换培养基，所述细胞完全培养基如本专利技术第一个方面所述。
[0017]在一些实例中，所述细胞包括但不限于不同来源的干细胞、成纤维细胞、癌旁组织细胞、上皮细胞、脂肪细胞、癌细胞、神经细胞、甲状腺细胞、软骨细胞、角质细胞、骨髓细胞、心肌细胞。
[0018]在一些实例中，所述细胞为成纤维细胞，所述培养基的组成为：基础培养基75体积份、血清替代物24体积份、补充剂1体积份，其中：基础培养基为DMEM/F12；血清替代物为Ultra CULTURETM Serum
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free medium；补充剂为Penicillin
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Streptomycin。
[0019]在一些实例中，所述成纤维细胞为人源成纤维细胞。
[0020]在一些实例中，所述细胞为间充质干细胞，所述培养基的组成为：基础培养基65体积份、血清替代物33体积份、补充剂2体积份，其中：基础培养基为DMEM basic(1X)（高糖）；血清替代物为KnockOut
TM DMEM(1X)；补充剂为PEN STREP GLUTAMINE。
[0021]在一些实例中，所述间充质干细胞为人脐带来源间充质干细胞。
[0022]本专利技术的第三个方面，提供：一种细胞分泌物的制备方法，包括：按本专利技术第二个方面所述的细胞培养方法培养细胞；收集培养液上液，分离、纯化得到目的细胞分泌物。
[0023]在一些实例中，所述细胞分泌物包括但不限于外泌体、生长因子、细胞因子、胶原提取物、功能性蛋白如纤连蛋白、弹性蛋白等。细胞因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、肝细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞完全培养基，由基础培养基、血清替代物和补充剂组成，其中：基础培养基的用量为50～80体积份，选自MEM、F12、低糖DMEM、高糖DMEM中的至少一种；血清替代物的用量为5～50体积份，选自KnockOut
TM DMEM、Ultra CULTURE
TM Serum
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free medium、EliteGro
TM 、EliteGro
TM
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Adv、Ultroser
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G中的至少一种；补充剂的用量为0～5体积份，选自PEN STREP GLUTAMINE、Penicillin
‑
Streptomycin、Sodium Pyruvate、L
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GlutaMax中的至少一种。2.根据权利要求1所述的细胞完全培养基，其特征在于：其组成为：基础培养基65体积份、血清替代物33体积份、补充剂2体积份，其中：基础培养基为DMEM basic(1X)（高糖）；血清替代物为KnockOut
TM DMEM(1X)；补充剂为PEN STREP GLUTAMINE；或基础培养基75体积份、血清替代物24体积份、补充剂1体积份，其中：基础培养基为DMEM/F12；血清替代物为Ultra CULTURETM Serum
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free medium；补充剂为GlutaMAX
™
。3.一种细胞培养方法，包括将细胞接种于细胞完全培养基内并及时更换培养基，其特征在于：所述细胞完全培养基如权利要求1或2所述。4.根据权利要求3所述的细胞培养方法，其特征在于：所述细胞为不同来源的干细胞、成纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏黎明，王亮，陈钰莹，万阳，
申请(专利权)人：广州益养生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：