一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基制造技术

本发明专利技术提供一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基，即肌肉干细胞体外诱导分化的无血清的更高效、廉价的化学成分明确的培养基。该化学成分明确的培养基相较于现有的一般肌肉干细胞分化培养基，在分化第2天能够提高MYOG基因的相对表达量4.48倍，在分化第6天提高MYHC基因的相对表达量55.28倍，在终末分化阶段的细胞分化百分比从34.94％提高到57.93％，存在极显著差异，并且诱导分化形成的肌纤维更多、更粗、更长。该化学成分明确分化培养基的发明专利技术，进一步提高了肌肉干细胞的分化效率，为肌肉干细胞更高效地分化成肌管，为3D培养肌肉干细胞生产细胞培养肉提供了更高效、廉价的方法。价的方法。价的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基


[0001]本专利技术属于干细胞和动物细胞培养肉
，具体地，涉及一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基。

技术介绍

[0002]细胞培养肉是依据动物肌肉生长修复机理，利用其干细胞进行体外培养而获得的肉类，它不需要经过动物养殖，直接用细胞工厂化生产肉类。细胞培养肉作为一种颠覆性肉类生产方式为补充未来肉类蛋白供应、实现肉类绿色生产提供了新的途径。根据测算，相较于传统的畜牧业，细胞培养肉产业能减少35％到60％的能耗、少占用98％的土地和少产生80％以上的温室气体。
[0003]肌肉干细胞又称卫星细胞，位于基底膜的下方，源自脊椎动物胚胎形成早期的中胚层，是骨骼肌再生的必要条件。肌肉损伤后，肌肉干细胞被激活进入细胞周期，并迅速增殖，大多数细胞进行分化融合形成肌纤维，少数细胞自我更新后恢复静息状态，以补充卫星细胞池。相似地，培养肉在体外生产过程需要种子细胞富集后进行诱导分化，促使大部分肌肉干细胞融合形成肌纤维，因此选择一种优良的细胞分化培养基是培养肉生产过程中的关键一环，直接影响肌管融合与蛋白产生。
[0004]目前普遍使用的体外肌肉干细胞诱导分化的培养基配方是DMEM基础培养基加入2％马血清和1％双抗。该培养基能够支持基本的细胞分化过程，在分化第5天左右达到最高肌管融合率。但是该培养基由于马血清的添加，导致化学成分不明确，存在不同批次培养基成分不稳定、易存在病毒等病原体污染、成本昂贵等问题。此外，该培养基条件下的肌肉干细胞分化百分比仅为35％左右，分化效率低。这意味运用该含血清培养基无法大规模高效、稳定、廉价地生产细胞培养肉，严重阻碍了细胞培养肉产业化的进程。因此，开发一种化学成分明确的、能够促进肌肉干细胞高效分化的无血清分化培养基变得尤为重要。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是替代传统分化培养基中的血清成分，提供一套化学成分明确的肌肉干细胞分化培养基及其应用方法。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基，所述改良细胞分化培养基为不含血清成分。所述无血清成分是指不添加有包括马血清、胎牛血清、牛血清、人血清等任何动物血清成分，所述改良细胞分化培养基为添加有细胞培养辅助因子的肌肉干细胞分化培养基，通过添加辅助因子，替代传统肌肉干细胞分化培养基中的血清成分。
[0007]进一步的，所述肌肉干细胞分化培养基包括肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液，所述肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液的体积比为99:1(v/v)；
[0008]优选的，所述肌肉干细胞基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种；
[0009]优选的，所述的青霉素
‑
链霉素双抗溶液，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
[0010]进一步的，所述细胞培养辅助因子自以下细胞培养补充因子中的多种：N
‑2‑
羟乙基哌嗪
‑
N
‑2‑
乙烷磺酸、PEG
‑
PPG
‑
PEG、血清白蛋白、吐温、转铁蛋白、乙醇胺、胆固醇、维生素E、棕榈酸、硬脂酸、胰岛素、棕榈油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、亚硒酸钠、亚油酸、IGF(胰岛素样生长因子)。
[0011]进一步的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为：0.05
‑
50mg/mL。
[0012]优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为：0.5
‑
30mg/mL。
[0013]进一步优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度为3mg/mL。
[0014]进一步的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为0.5ng/mL100mg/ml。
[0015]优选的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为50ng/mL
‑
50mg/ml；
[0016]进一步优选的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为50ng/mL
‑
1.2mg/ml。
[0017]本专利技术的第二个目的是提供前述的用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基在体外诱导肌肉干细胞分化中的应用，具体的，为采用前述的改良细胞分化培养基对肌肉干细胞进行体外诱导分化。
[0018]进一步的，所述的改良细胞分化培养基能够在体外诱导分化过程中促进肌肉干细胞分化。具体的，能够提高肌肉干细胞在体外诱导分化过程中的分化效率、分化能力、分化水平。
[0019]进一步的，所述的改良细胞分化培养基能够提高肌肉干细胞在体外诱导分化过程中MYOG、MYHC、CAV
‑
3基因表达量。
[0020]进一步的，所述的改良细胞分化培养基能够提高肌肉干细胞在体外诱导分化过程中肌球蛋白重链蛋白(MYHC)的合成
[0021]作为该应用的一种特殊的实施方式，采用前述用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基，体外诱导肌肉干细胞分化方法，包括下列步骤：
[0022]1)取经过纯化后的原代肌肉干细胞；
[0023]2)采用肌肉干细胞增殖培养基在经过基质胶铺板的培养皿中扩增肌肉干细胞至90％以上的密度；
[0024]3)吸去肌肉干细胞增殖培养基后，加入前述改良细胞分化培养基润洗细胞，再次吸去培养基，重新补充新的改良细胞分化培养基，继续培养，诱导分化；
[0025]4)每隔2天采用前述改良细胞分化培养基进行半换液，继续培养，直至细胞融合形成肌纤维。
[0026]采用本专利技术所述的改良细胞分化培养基对肌肉干细胞进行体外诱导分化5天后，有57.93％的细胞融合形成肌纤维。
[0027]其中，步骤1)中纯化后的细胞指从幼猪身上分离得到的，经过细胞流式分选仪分选后，Pax7表面抗体阳性率在90％以上的肌肉干细胞。
[0028]进一步的，前述细胞培养的环境条件为在CO2培养箱中37℃培养，CO2培养箱中CO2浓度为5％(v/v)。
[0029]进一步的，步骤2)中采用的基质胶铺板浓度为基质胶：PBS＝1：50(Val)。所采用的肌肉干细胞增殖培养基为20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及1
‑
10ng/ml成纤维细胞生长因子。
[0030]本专利技术的第三个目的是提供前述的改良细胞分化培养基在制备培养肉中的应用，所述应用包括以下步骤：
[0031]1)将I型胶原、含酚红的DMEM培养基、氢氧化钠溶液混合，得到混合溶液。
[0032]2)将肌源性细胞与步骤1)获得的混合溶液混合后，得到含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述改良细胞分化培养基为添加有细胞培养辅助因子的肌肉干细胞分化培养基，所述改良细胞分化培养基不含血清成分。2.根据权利要求1所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述肌肉干细胞分化培养基包括肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液，所述肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液的体积比为99:1；优选的，所述肌肉干细胞基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种；优选的，所述的青霉素
‑
链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。3.根据权利要求1所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述细胞培养辅助因子选自以下细胞培养补充因子中的多种：N
‑2‑
羟乙基哌嗪
‑
N
‑2‑
乙烷磺酸、PEG
‑
PPG
‑
PEG、血清白蛋白、吐温、转铁蛋白、乙醇胺、胆固醇、维生素E、棕榈酸、硬脂酸、胰岛素、棕榈油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、亚硒酸钠、亚油酸、IGF。4.根据权利要求1所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为：0.05
‑
50mg/mL；优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为0.5
‑
30mg/mL；进一步优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度为3mg/mL。5.根据权利要求3所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为0.5ng/mL
‑
100mg/ml；优选的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为50ng/mL
‑
50mg/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：周光宏，吴中元，徐幸莲，丁世杰，李惠侠，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：