诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂技术

本发明专利技术公开了一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂，属于人多能干细胞向心肌细胞分化调控及维持技术领域。该诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法包括：将人多能干细胞置于含烟酰胺的第一培养基中培养，第一培养基为E5培养基。心肌细胞的传代方法包括：将心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中培养，第二培养基为E6培养基。心肌细胞的纯化方法包括：将传代处理后的心肌细胞置于含烟酰胺的第三培养基中培养，第三培养基为E6培养基。上述方法能够为人多能干细胞来源的心肌细胞的产生和传代培养提供有效可行的新方法，且效率稳定，费用较低，利于大规模生产。相应的药剂应用前景较广。产。相应的药剂应用前景较广。产。相应的药剂应用前景较广。

【技术实现步骤摘要】
诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂


[0001]本专利技术涉及人多能干细胞向心肌细胞分化调控及维持
，具体而言，涉及一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化及心肌细胞传代与纯化的方法及药剂。

技术介绍

[0002]人类多能干细胞(hPSCs)可以分化为我们体内的所有细胞类型，是研究人类胚胎发育的重要模型系统。通过hPSC分化产生的特定细胞类型在细胞治疗，药物筛选和疾病模型研究中有极大的作用。心肌细胞具有不可再生性，因此由hPSC分化产生的心肌细胞为心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供了材料。目前常用的小分子抑制剂诱导心肌细胞的方法效率不稳定，并且费用较高，不利于大规模生产。
[0003]此外，如何培养和维持hPSC诱导分化的心肌细胞，仍存在诸多困难。例如hPSC诱导分化的心肌细胞很难传代，细胞存活率低。并且长期培养会降低心肌细胞的纯度，不利于心肌细胞用于再生修复以及药物筛选。因此开发经济有效的分化方法，以及后续的心肌细胞传代和维持心肌细胞的纯度，对于其应用具有重大意义。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一包括提供一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法。
[0006]本专利技术的目的之二包括提供一种心肌细胞的传代方法。
[0007]本专利技术的目的之三包括提供一种心肌细胞的纯化方法。
[0008]本专利技术的目的之四包括提供一种含有经上述方法得到的心肌细胞的药剂。
[0009]本申请可这样实现：
[0010]第一方面，本申请提供一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法，包括以下步骤：将人多能干细胞置于含烟酰胺的第一培养基中培养，第一培养基为E5培养基。
[0011]在可选的实施方式中，烟酰胺在第一培养基中的浓度不低于10mmol/L。
[0012]在可选的实施方式中，烟酰胺对人多能干细胞的作用时间为4
‑
6天。
[0013]在可选的实施方式中，先将人多能干细胞向中胚层分化，再加入烟酰胺诱导向心肌方向分化。
[0014]在可选的实施方式中，通过打开Wnt/β
‑
catenin通路诱导人多能干细胞向中胚层分化。
[0015]在可选的实施方式中，采用GSK3β抑制剂CHIR99021打开Wnt/β
‑
catenin通路。
[0016]在可选的实施方式中，向中胚层分化是以细胞密度为60
‑
80％的人多能干细胞进行。
[0017]在可选的实施方式中，向中胚层分化过程所用的培养基为不含TGFβ、FGF2以及胰岛素但含脂质浓缩物的E5培养基。
[0018]在可选的实施方式中，还包括在用含烟酰胺的第一培养基培养后，用含胰岛素的E5培养基继续培养分化。
[0019]第二方面，本申请提供一种心肌细胞的传代方法，包括以下步骤：将心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中培养，第二培养基为E6培养基。
[0020]在可选的实施方式中，烟酰胺在第二培养基中的浓度不低于10mmol/L。
[0021]在可选的实施方式中，心肌细胞为经上述诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到的心肌细胞。
[0022]在可选的实施方式中，心肌细胞为人多能干细胞往心肌细胞方向分化后第10
‑
15天的心肌细胞。
[0023]在可选的实施方式中，心肌细胞为人多能干细胞经IWP
‑
2或烟酰胺诱导的心肌细胞。
[0024]在可选的实施方式中，烟酰胺通过抑制ROCK通路促进心肌细胞存活。
[0025]在可选的实施方式中，将消化成单细胞后的心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中，培养1
‑
2天后换成不含烟酰胺的第二培养基继续培养。
[0026]在可选的实施方式中，采用TrypLE进行消化处理，随后用牛血清白蛋白中和反应，固液分离，将除去消化液后的呈单细胞状态的心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中。
[0027]第三方面，本申请提供一种心肌细胞的纯化方法，包括以下步骤：将传代处理后的心肌细胞置于含烟酰胺的第三培养基中培养，第三培养基为E6培养基。
[0028]在可选的实施方式中，烟酰胺在第三培养基中的浓度不低于10mmol/L。
[0029]在可选的实施方式中，传代处理的方法为上述传代方法。
[0030]在可选的实施方式中，传代以1:3
‑
1:4的比例进行。
[0031]在可选的实施方式中，传代过程中加有ROCK抑制剂或烟酰胺。
[0032]在可选的实施方式中，ROCK抑制剂为Y27632。
[0033]在可选的实施方式中，ROCK抑制剂的添加浓度为5
‑
20μmmol/L，烟酰胺的添加浓度为10
‑
20mmol/L。
[0034]在可选的实施方式中，心肌细胞在含烟酰胺的第三培养基中培养4
‑
6天，每2
‑
3天更换一次新的含烟酰胺的第三培养基。
[0035]第四方面，本申请提供一种药剂，其含有经上述诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到的心肌细胞。
[0036]第五方面，本申请提供一种药剂，其含有经上述心肌细胞的传代方法得到的心肌细胞。
[0037]第六方面，本申请提供一种药剂，其含有经上述心肌细胞的纯化方法得到的心肌细胞。
[0038]本申请的有益效果包括：
[0039]本申请提供的诱导干细胞往心肌细胞方向分化以及心肌细胞传代与纯化的方法能够为人多能干细胞来源的心肌细胞的产生和传代培养提供有效可行的新方法，且效率稳定，费用较低，利于大规模生产。由上述得到心肌细胞存活率及纯度较高，含有经上述方法得到的心肌细胞的药剂应用前景较广，可为心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供材料。
附图说明
[0040]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0041]图1为不同浓度和不同时间的烟酰胺处理对hPSC H1细胞向心肌方向分化的影响图；
[0042]图2为烟酰胺诱导H1细胞向心肌细胞方向分化图；
[0043]图3为心肌细胞的细胞骨架和电生理功能分析；
[0044]图4为烟酰胺诱导hPSC H9细胞和iPSC NL4向心肌方向分化图；
[0045]图5为烟酰胺促进心肌细胞传代后存活图；
[0046]图6为烟酰胺促进烟酰胺诱导分化的心肌细胞传代后存活图；
[0047]图7为烟酰胺提高心肌细胞的纯度图。
具体实施方式
[0048]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：将人多能干细胞置于含烟酰胺的第一培养基中培养，所述第一培养基为E5培养基；优选地，所述烟酰胺在所述第一培养基中的浓度不低于10mmol/L；优选地，所述烟酰胺对所述人多能干细胞的作用时间为4
‑
6天。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先将所述人多能干细胞向中胚层分化，再加入所述烟酰胺诱导向心肌方向分化；优选地，通过打开Wnt/β
‑
catenin通路诱导所述人多能干细胞向中胚层分化；优选地，采用GSK3β抑制剂CHIR99021打开所述Wnt/β
‑
catenin通路；优选地，向中胚层分化是以细胞密度为60
‑
80％的人多能干细胞进行；优选地，向中胚层分化过程所用的培养基为不含TGFβ、FGF2以及胰岛素但含脂质浓缩物的E5培养基。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括在用含所述烟酰胺的所述第一培养基培养后，用含胰岛素的E5培养基继续培养分化。4.一种心肌细胞的传代方法，其特征在于，包括以下步骤：将心肌细胞置于含烟酰胺的第二培养基中培养，所述第二培养基为E6培养基；优选地，所述烟酰胺在所述第二培养基中的浓度不低于10mmol/L；优选地，所述心肌细胞为经权利要求1
‑
3任一项所述的诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法得到的心肌细胞；优选地，所述心肌细胞为人多能干细胞往心肌细胞方向分化后第10
‑
15天的心肌细胞；优选地，所述心肌细胞为人多能干细胞经IWP
‑
2或烟酰胺诱导的心肌细胞；优选地，所述烟酰胺通过抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国凯，孟雅，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：