一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，涉及北芪菇中活性物质提取和含量测定领域，以北芪菇为原料，以乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化，采用光谱扫描确定的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据标准品吸收峰峰面积积分值与量的线性关系，用外标两点法测定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，双波长薄层扫描法使目标物质充分溶解于提取剂中，扫描法可基本消除铺板不均产生的误差，扫描基线稳定，不造成目标物质的损失，且操作简单、用时短，具有提取效率高，可定性分析准确性高。

A Method for the Determination of Astragaloside in Astragalus membranaceus

The invention discloses a method for determining the content of astragaloside in Beiqi mushroom, which relates to the field of extraction and determination of active substances in Beiqi mushroom. Using Beiqi mushroom as raw material, ethanol as extractant, the ratio of material to liquid is 1:25, the crude extract of astragaloside is obtained by microwave and ultrasound assisted, and the volume ratio of chloroform: methanol: ethyl acetate: water is 13:7:2 as developing agent, and is separated by thin layer chromatography. Separation and purification, the determination wavelength and reference wavelength determined by spectral scanning, and then the absorption peak area integral value of each spot were determined by reflection scanning. According to the linear relationship between the absorption peak area integral value and the quantity of standard product, the contents of astragaloside A and astragaloside I, II and III were determined by external standard two-point method. The target substance was fully dissolved in the extractant by dual-wavelength TLC scanning. The scanning method can basically eliminate the errors caused by uneven paving, and the scanning baseline is stable. It does not cause the loss of the target material. It is simple to operate and takes a short time. It has high extraction efficiency and high accuracy of qualitative analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法
本专利技术涉及北芪菇中活性物质的提取与含量测定领域，具体为一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法。
技术介绍
北芪菇，担子菌门下伞菌目侧耳属平菇，将正北芪、多种中草药、农作物副产品作培养料，采用科学的配方和特殊的工艺多年培育而成的新型侧耳属平菇，是山西浑源富硒地区开发的新型食用菌。根据生物富集作用，北芪菇内含浑源黄芪的药理成分，在生长发育过程中对黄芪苷有一定程度的富集。北芪菇中含有多种人体必需的氨基酸、多糖蛋白、抗生素、牛黄酸、菌糖、多种酶、维生素以及硒元素，是全能营养型的食用菌，其营养成份远超于普通平菇，含有较高的食用价值和药用价值。北芪菇具有较强的生物转化作用，其重要的代谢产物，如蛋白多糖、抗生素、微量牛黄酸有抗肿瘤、抗菌消炎、降低血压和防治脑血管障碍等作用，菌多糖和甘露糖有益于调理胃肠作用，以及含有帮助消化的各种酶等。在补气固表、润肤、脱毒排脓、有强身健体、保护肝脏等有较为显著的作用，尤其是在治愈银霄病和其它瘙痒性皮肤病有特殊的功效。另外，北芪菇是一种能产生新型氨基酸的微生物，其丰富的赖氨酸（1.19g/100g）和硒（0.54ppm/100g）可能与吡咯赖氨酸和L-硒代半胱氨酸或L-硒-甲基硒代半胱氨酸的生物合成存在着密切的关系，有望在抑制肿瘤、抗氧化、辅助治疗心血管疾病、解毒排毒等方面进行开发。近年我国对不同植物中的黄芪苷进行了各方面的研究，相继报道了黄芪苷有免疫调节、抗炎，降压，镇静镇痛，保肝护心，清除多种自由基等多方面的药理作用。关于黄芪中黄芪苷的提取及含量测定早有报道，但对产于山西浑源县北芪菇中黄芪苷的含量少有报道，如今北芪菇中黄芪苷的研究备受人们重视，有关黄芪苷的研究变成了科学界的热点。随着社会经济和科学技术的发展，黄芪苷的开发研究和应用范围会更广，开发前景会更好，从而促进医疗事业的发展。北芪菇中的黄芪苷以黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪甲苷为主。黄芪皂苷在抗氧化、调节免疫功能、保肝、抗病毒和对心脑血管等多方面具有显著作用。有关黄芪皂苷的鉴别通常采用相继报道了水浸提法，碱水提取法，回流法、CO2超临界流体萃取法等多种方法。黄芪皂苷的含量测定曾尝试采用高效液相一紫外检测器检测，但由于黄芪皂苷在紫外区仅有微弱的吸收，溶剂噪音对结果有较大影响，灵敏度低，测定误差大。黄芪甲苷为环阿尔廷型三萜皂苷类化合物，生物活性高，是黄芪的主要药理成份，是黄芪及含黄芪制剂的重要鉴定指标。黄芪甲苷对人体拥有非常高的药理作用，其在器官保护（尤其是肝脏、肺、心肌、肾脏、脑等器官）、免疫调节、抗细胞凋亡、抗炎抗病毒、抗糖尿病、清除自由基、抗衰老等方面具有广泛的药理作用。黄芪甲苷的常见提取方法主要有水浸提法，碱水提取法，醇提法、煎煮法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、索式提取法、超临界CO2萃取法及加速溶剂萃取法，黄芪甲苷含量测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、荧光、紫外分光光度法等。但是上述方法操作步骤繁琐，测定时间长，例如索氏回流提取需要碱洗及大孔树脂富集过程，洗脱富集复杂，不易操作，同时含量测定过程中由于黄芪甲苷仅在近紫外区（200nm左右）有微弱吸收，属于末端吸收，因为波长越长，噪音就越大，灵敏度也随之降低。在大多数化学实验室，薄层色谱（TLC）是一种常用、可靠的方法，但传统的可见技术不提供薄层色谱斑点的结构信息。质谱法是一种鉴定这些斑点的强大技术，然而传统的从薄层板上手动刮点、萃取、重组，进而在质谱上注射分析获取质谱图的过程耗时耗力。因此需要一种能解决测定过程操作繁琐、测定结果不可靠的问题的含量测定方法。
技术实现思路
为解决北芪菇中黄芪苷的提取和黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ与黄芪甲苷含量测定的操作繁琐、测定结果不可靠的问题，本专利技术提供了一种易于操作、试验耗时短且提取效率高的北芪菇中黄芪苷含量测定的方法。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，具体过程为：以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理后，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，采用双波长薄层扫描法测定北芪菇中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。进一步地，具体过程为：步骤a，以北芪菇粉为原料，分别加入70%乙醇，料液比为1:25，50℃下振荡浸提，超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，超声波频率为50KHz，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，上清液过滤、浓缩，石油醚去杂后，用饱和正丁醇萃取，合并上层溶液、浓缩至无液体溢出时用甲醇将其定容备用；步骤b，将黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ标准品加于色谱纯的甲醇中，超声条件下充分溶解后制得1mg/mL的标准品溶液，置于2～4℃的冰箱中保存备用；步骤c，将层析板加热活化，用微量进样器分别吸取北芪菇、正北芪供试品溶液及标准品溶液25μL，依次点样供试液3-4μL，标准品溶液2μL、3μL、6μL，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2静置过夜的下相为供试品展开剂，密封后，预饱和20min，放入层析缸中上行展开，待展开前沿距层析板顶端1cm处时，取出层析板晾干，均匀喷10%的硫酸乙醇溶液，于105℃加热至显色清晰为止，用玻璃板覆盖，四周胶布固定，紫外365nm下检视，薄层色谱成像系统拍照，并标记；步骤d，将层析板放入薄层色谱扫描仪中，确定背景及各个黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ斑点的横、纵坐标，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。与现有技术相比较本专利技术的有益效果在于：微波联合超声波提取比单一的超声波、微波提取效率更高。该方法不仅能使细胞内的目标物质充分溶解于提取剂中，不造成目标物质的损失，而且操作简单、用时短，大大的提高了提取效率，广泛的适用于各种物质的提取。薄层色谱相对于纸色谱法、高效液相色谱、高效气相色谱和高速逆流色谱法，展开速率快，一般仅需15～20分钟，混合物易分离，分辨力比纸层析高10～100倍，保持了操作方便、设备简单、显色容易等优点。同时既适用于只有0.01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。双波长扫描完全消除由于薄层厚度局部不均所引起的基线波动。锯齿形扫描消除了由被展开斑点不规则形状所引起的测量误差。工作曲线线性化保证了工作曲线呈一直线，提高了分析准确度。背景校正功能消除薄板背景污染的影响，可将背景作为基线储存起来，以得到校正过的吸收光谱。狭缝调节保证有适于电泳凝胶扫描本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，其特征在于，以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理后，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，采用双波长薄层扫描法测定北芪菇中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，其特征在于，以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理后，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，采用双波长薄层扫描法测定北芪菇中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。2.根据权利要求1所述的一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，其特征在于，该具体过程为：步骤a，以北芪菇粉为原料，分别加入70%乙醇，料液比为1:25，50℃下振荡浸提，超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，超声波频率为50KHz，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，上清液过滤、浓缩，石油醚去杂后，用饱...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卫民，左崇香，赵青红，秦永其，杜京旗，张利军，闫艳华，
申请(专利权)人：吕梁学院，
类型：发明
国别省市：山西,14