The invention discloses a purification process for polysaccharides of Haemophilus type b, which comprises the steps of tangential flow ultrafiltration membrane-wrapped ultrafiltration, ceramic hydroxyapatite chromatography, tangential flow ultrafiltration membrane-wrapped ultrafiltration desalination concentration and freeze-drying. The invention has the advantages of avoiding the use of phenol, preventing the harm of phenol to the environment and people, reducing the use of ethanol, and reducing the flammability and explosive danger in the use of ethanol; the combination of tangential flow ultrafiltration membrane bag and hydroxyapatite makes the content of protein and nucleic acid lower, and has the significance of production enlargement; and the combination of direct and freeze-drying process obtains more low water content. Sugar products and polysaccharides are more stable.
【技术实现步骤摘要】
一种b型嗜血杆菌多糖的纯化工艺
:本专利技术涉及多糖疫苗领域中的多糖纯化,具体涉及b型流感嗜血杆菌(Hib)多糖纯化。
技术介绍
:包括Hib多糖疫苗、结合疫苗及相关多价疫苗的制备过程中,多糖的制备是其关键步骤。当前国际上Hib多糖提取纯化采用相似的工艺。利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀发酵液离心后的上清液,获得混有核酸、蛋白的复合糖。溶解复合糖后使用不同浓度的乙醇分步沉淀获得粗糖。粗糖使用苯酚抽提去除蛋白质,再次使用乙醇沉淀,最终获得低蛋白含量、低核酸含量的Hib精糖。该工艺使用大量苯酚、乙醇。一方面苯酚作为具有腐蚀性、高度毒性的化学试剂,对环境具有严重危害,污染空气及水体;大量乙醇存放对生产厂房的安全要求较高。另一方面苯酚对人体皮肤、黏膜有强烈的腐蚀作用,抑制中枢神经,损害肝、肾功能,危害生产操作人员身体健康。同时,疫苗成品中存在的苯酚残留也对使用者身体健康存在潜在危害。因此摒弃苯酚使用,减少乙醇使用,采用新工艺纯化多糖具有实际意义。专利号CN201210037245.2,专利技术名称为一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法,该专利公布了一种利用羟基磷灰石进行b型嗜血杆菌多糖纯化的方法。该方法不再使用苯酚进行蛋白去除,采用层析进行多糖纯化,去除蛋白。本专利工艺相比该专利方法,增加了羟基磷灰石层析前切向流超滤膜包超滤处理,进一步降低了蛋白、核酸含量,同时控制了层析上样溶液的离子浓度;层析过程,使用浓度更低的磷酸盐浓度;层析柱再生不使用氯化钠,使用浓度更高的磷酸盐浓度,提高层析柱使用寿命;层析后,使用切向流超滤膜包超滤代替G-25凝胶柱,更具工业应 ...
【技术保护点】
1.一种b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化工艺,包括以下步骤:1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中,使用切向流超滤膜包进行超滤,获得超滤溶液;2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析,获得层析液;3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩,获得浓缩液;4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖。
【技术特征摘要】
1.一种b型嗜血杆菌荚膜多糖的纯化工艺,包括以下步骤:1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中,使用切向流超滤膜包进行超滤,获得超滤溶液;2)超滤溶液通过陶瓷羟基磷灰石层析柱进行层析,获得层析液;3)使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩,获得浓缩液;4)将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖。2.根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,步骤1):使用浓度为5~15mmol/L、pH6~8磷酸盐缓冲液溶解粗多糖至浓度为3~10mg/mL,使用切向流超滤膜包进行超滤,超滤透过体积为粗多糖溶液的10~50倍体积,温度控制在8~15℃,切向流超滤膜包型号为30~300KD,超滤获得超滤溶液。3.根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,步骤2):将超滤溶液上样至陶瓷羟基磷灰石层析柱上,收集206nm显示的流穿峰获得层析液,使用高浓度的PB缓冲液洗脱蛋白与核酸;其中,陶瓷羟基磷灰石柱高范围16~24cm,上样量0.5~1.5CV(柱体积),流速100~300cm/h;其中,高浓度的PB缓冲液浓度为200~500mmol/L磷酸盐缓冲液、pH在6.5~8之间。4.根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,步骤3):使用切向流超滤膜包对层析液进行超滤脱盐、浓缩,获得浓缩液;超滤中添加水为注射用水,超滤倍数为10~50倍;最终浓缩为层析液体积的1/10~1/2,温度控制在8~15℃,切向流超滤膜包型号为30~300KD。5.根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,步骤4):将浓缩液冻干获得固体b型嗜血杆菌荚膜多糖,其中冻干过程分为:预冻干、冻干、二次冻干三个阶段;预冻干的温度在-30~-55℃,时间为2~5小时;冻干的温度在-30~-35℃,时间为10~24小时;二次冻干温度在15~30℃,时间为2~10小时。6.根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,包括以下步骤:(1)将粗多糖溶解于PB缓冲液中,使用切向流超滤膜包进行超滤,获得超滤溶液:粗多糖浓度5mg/mL,PB缓冲液浓度为5mmol/L、pH...
【专利技术属性】
技术研发人员:高磊,苏晓叶,石献华,程亚君,李倩,
申请(专利权)人:北京智飞绿竹生物制药有限公司,重庆智飞生物制品股份有限公司,安徽智飞龙科马生物制药有限公司,
类型:发明
国别省市:北京,11
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