一种辣木叶多糖MLP20-1的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种具有α‑糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖MLP20‑1的制备方法及其应用。本发明专利技术提供了辣木叶多糖MLP20‑1的制备方法、该多糖的α‑糖苷酶抑制活性以及该发明专利技术可应用于制备降血糖药物以及治疗肥胖症的药物的用途。

Preparation and Application of a Moringa oleifera Leaf Polysaccharide MLP20-1

The invention relates to a preparation method and application of Moringa oleifera leaf polysaccharide MLP20 1 with alpha glycosidase inhibitory activity. The invention provides a preparation method of Moringa oleifera leaf polysaccharide MLP20 1, an alpha glycosidase inhibitory activity of the polysaccharide, and the use of the invention in preparing hypoglycemic drugs and in treating obesity.

【技术实现步骤摘要】
一种辣木叶多糖MLP20-1的制备方法及其应用
本专利技术涉及一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖MLP20-1的制备方法及其应用，属于天然产物化学领域，制得的多糖具有α-糖苷酶抑制活性，在糖尿病的治疗中具有重要的应用价值。
技术介绍
辣木是一种多年生落叶乔木，广泛种植于热带以及亚热带国家。辣木的茎、叶、根、花等部位皆可食用，在东南亚国家常被用于木本蔬菜。辣木种子油脂含量丰富，还含有大量的氨基酸、钾、锌、氨基酸、维生素以及高不饱和脂肪酸、蛋白质、甾醇等，被作为高营养蔬菜和药材开发利用。辣木耐热性、耐旱性较强，生长迅速，因其含有丰富的营养价值、广泛的应用前景得到人们越来越多的青睐，如今，在我国的云南、广东、福建辣木得到了大面积的种植。除含有丰富的营养价值外，辣木还具有较强的抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗溃疡活性，辣木可用于临床上止痛降压、预防免疫力低下、治疗高血压和糖尿病等方面，尤其是应用于婴儿和哺乳母亲方面，其对抗营养失调及预防疾病表现出较显著的效果。糖尿病，病理复杂，其主要特征表现为高血糖、葡萄糖耐受量低，患病初期无明显症状，后期才会出现“三多一少”的症状。目前，基础血糖量高是引发并发症的主要原因，因此在糖尿病的临床治疗中抑制糖分解，缓解糖吸收是重要举措之一。α-糖苷酶是一组存在于小肠绒毛膜刷状缘上的双糖水解酶，包括麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶等。它将食物中的双糖以及寡糖水解为葡萄糖，经过小肠上皮细胞的吸收进入血液循环，从而引起餐后血糖水平的升高。因此，餐后血糖水平与α-糖苷酶的活性有着密切的关系，α-糖苷酶抑制剂作为一种降血糖的药品得到越来越多的关注，目前已有几个α-糖苷酶抑制剂开发上市，比如阿卡波糖、米格列醇等。本专利技术制备的辣木叶多糖具有较强的α-糖苷酶抑制活性，可应用于制备降血糖药物以及治疗肥胖症的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖MLP20-1的制备方法及其应用。本专利技术通过以下技术方案来实现：一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1∶10-1∶20的料液比于100℃下浸提120min，65℃超声水浴处理1h，将得到的辣木叶粗多糖提取液置于56℃，800W下悬蒸浓缩，加入3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，离心，复溶。利用复合酶制剂(碱性蛋白酶∶胰蛋白酶＝8∶2)法脱蛋白，重复2-3次，直至无白色絮状沉淀析出。(2)20％醇沉向脱蛋白后的辣木叶多糖溶液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积为20％，4℃下醇沉过夜，离心、去上清，得到20％醇沉辣木叶多糖提取液。(3)阴离子交换柱层析分离纯化将第(2)步中得到的辣木叶多糖提取液复溶，溶液经过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析分离，用0-1.0M的NaCl溶液洗脱，洗脱液经透析浓缩，真空冷冻干燥，得到辣木叶多糖MPL20-1粉末。一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木茎多糖MPL20-1的应用，其特征在于，此种辣木叶多糖的提取率高，对α-糖苷酶具有较好的抑制活性，并可有效调节STZ诱导的糖尿病小鼠的血糖水平，可应用于降血糖药物以及治疗糖尿病、肥胖症药物的制备。附图说明图1：辣木叶多糖20％醇沉组分的DEAE-SepharoseFastFlow洗脱曲线图2：辣木叶多糖MLP20-1的α-糖苷酶体外抑制活性具体实施方式下面，结合实施例对本专利技术做进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，对于本领域的技术人员来说，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护之中。实施例1辣木叶多糖MLP20-1的制备(1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1∶20的料液比于100℃下浸提120min，65℃超声水浴处理1h，将得到的辣木叶粗多糖提取液置于56℃，800W下悬蒸浓缩，加入3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，离心，复溶。利用复合酶制剂(碱性蛋白酶∶胰蛋白酶＝8∶2)法脱蛋白，重复3次，直至无白色絮状沉淀析出。(2)20％醇沉向脱蛋白后的辣木叶多糖溶液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积为20％，4℃下醇沉过夜，离心、去上清，得到20％醇沉梯度的辣木叶多糖提取液。(3)阴离子交换柱层析分离纯化将第(2)步中得到的辣木叶多糖提取液复溶，溶液经过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析分离，用0-1.0M的NaCl溶液洗脱，洗脱液组分MLP20-1经透析浓缩，真空冷冻干燥，得到20％醇沉梯度辣木叶多糖粉末MLP20-1。实施例2辣木叶多糖MLP20-1的α-糖苷酶体外抑制活性(1)溶液的配制：PBS溶液：0.1M，PH＝6.9；PNPG：5mM，PBS溶液溶解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液。α-糖苷酶溶液：1.0U/mL，PBS溶液溶解α-葡萄糖苷酶。阿卡波糖标准溶液：0.1-0.5mg/mL。(2)α-糖苷酶抑制活性的测定：以PNPG为底物，以P-硝基苯酚法测定α-糖苷酶活性，硝基苯酚的生成速率与α-糖苷酶的活性成正比。具体操作步骤为：向50μL实施例1和实施例2得到的各组分多糖溶液(0.1-0.5mg/mL)中加入100μLα-糖苷酶溶液，25℃下反应10min，405nm处测定吸光度值，然后继续加入50μL的PNPG，25℃下反应5min，405nm处再次测定吸光度值。空白组中以0.1M，PH＝6.9的PBS代替多糖溶液，标准组中以0.1-0.5mg/mL的阿卡波糖标准溶液代替多糖溶液。按以下公式计算α-糖苷酶的抑制率：％inhibition＝[(ΔAbs空白组-ΔAbs实验组)/ΔAbs空白组]×100计算辣木叶多糖MLP20-1对α-糖苷酶的抑制活性，结果如图1所示。MLP20-1的IC50为0.082mg/mL。实施例3辣木叶多糖MLP20-1对STZ诱导的糖尿病小鼠糖耐量的影响昆明雄、雌性鼠各15只，体重20-25kg，分为空腹组、对照组、拜唐平组、小剂量组、中剂量组、大剂量组。禁食20h后尾部静脉注册50mg/kg的STZ，选取血糖水平大于15mol/L且血糖水平相差不大的小鼠继续下一步的实验。空腹组灌胃生理盐水，对照组灌胃生理盐水和淀粉5g/kg，拜唐平组灌胃淀粉和拜唐平50mg/kg，小剂量组、中剂量组、大剂量组分别灌胃50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的辣木叶多糖，给药1h后测定多糖水平。血糖水平测定结果如表1所示。表1.辣木叶多糖MLP20-1对STZ诱导的糖尿病小鼠糖耐量的影响实施例4辣木叶多糖MLP20-1的傅里叶光谱分析对辣木叶多糖MLP20-1进行傅里叶红外光谱分析(德国BRUKER，型号VERTEX7.0)，结果表明，该多糖在3411.32cm-1处具有O-H伸缩振动峰；2937.51cm-1处具有-CH伸缩振动峰；2152.43cm-1处具有累积双键伸缩振动峰；1610.70cm-1处具有C＝O伸缩振动峰；1414.33cm-1处具有C-H伸缩振动峰；1242.13-1039.65cm-1处具有吡喃环结构伸缩振动峰；915.44cm-1处出现伸缩振动峰说明存在β-糖苷键结构；777.56cm-1处出现伸缩振动峰说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有α‑糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖MLP2‑10的制备方法，包括以下步骤(1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1∶10‑1∶20的料液比于100℃下浸提120min，65℃超声水浴处理1h，将得到的辣木叶粗多糖提取液置于56℃，800W下悬蒸浓缩，加入3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，离心，复溶。利用复合酶制剂(碱性蛋白酶∶胰蛋白酶＝8∶2)法脱蛋白，重复2‑3次，直至无白色絮状沉淀析出。(2)20％醇沉向脱蛋白后的辣木叶多糖溶液中加入无水乙醇，使无水乙醇的体积为20％，4℃下醇沉过夜，离心、去上清，得到20％醇沉辣木叶多糖提取液。(3)阴离子交换柱层析分离纯化将第(2)步中得到的辣木叶多糖提取液复溶，溶液经过DEAE‑Sepharose Fast Flow离子交换柱层析分离，用0‑1.0M的NaCl溶液洗脱，洗脱液经透析浓缩，真空冷冻干燥，得到辣木叶多糖MPL20‑1粉末。

【技术特征摘要】
1.一种具有α-糖苷酶抑制活性的辣木叶多糖MLP2-10的制备方法，包括以下步骤(1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1∶10-1∶20的料液比于100℃下浸提120min，65℃超声水浴处理1h，将得到的辣木叶粗多糖提取液置于56℃，800W下悬蒸浓缩，加入3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，离心，复溶。利用复合酶制剂(碱性蛋白酶∶胰蛋白酶＝8∶2)法脱蛋白，重复2-3次，直至无白色絮状沉淀析出。(2)20％醇沉向脱蛋白后的辣木叶多糖溶液中加入无水乙醇，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，崔璨，陈晓阳，王欣宇，姜峰，孙玉红，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44