一种具有抗血栓再形成功能的生物材料及其制备方法技术

本发明专利技术属于医用材料领域，具体涉及到一种模拟内皮细胞抗血栓再形成的生物材料及其制备方法。本发明专利技术提供一种具有抗血栓形成的生物功能材料，该材料通过化学方法将完整、稳定的脂质体固定于固体材料表面，在特定材料的表面稳定的、排列有序的脂质体覆盖层，利用“点击化学”的选择特异性，进一步用血栓调节蛋白修饰脂质体的表面实现脂质体的功能化，实现模拟内皮细胞的抗血栓功能。这种表面修饰了生物活性分子的材料，将极大的降低介入治疗（如冠心病的介入，支架）方法中由于介入器材的材料与血液接触后表面引起的不相容以及免疫系统应激反应所导致血栓再形成。

A Biological Material with Antithrombotic Reformation Function and Its Preparation Method

The invention belongs to the field of medical materials, in particular to a biological material simulating endothelial cell anti-thrombosis and its preparation method. The invention provides a biological functional material with anti-thrombosis. The material fixes a complete and stable liposome on the surface of solid material by chemical method, and a stable and orderly liposome covering layer on the surface of a specific material. By using the selective specificity of \click chemistry\, the function of the liposome is further realized by modifying the surface of the liposome with thrombomodulin. To simulate the anti-thrombotic function of endothelial cells. The surface modification of bioactive molecule material will greatly reduce thrombosis in interventional therapy (such as coronary artery disease intervention, stent) due to incompatibility between the material of interventional equipment and the surface after blood contact and immune system stress reaction.

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗血栓再形成功能的生物材料及其制备方法
本专利技术属于医用材料领域，具体涉及到一种模拟内皮细胞抗血栓再形成的生物材料及其制备方法。
技术介绍
具有纳米结构的生物功能材料在众多领域显示了诱人的应用前景，使其成为21世纪化学和材料学科最为活跃的研究领域之一，在生物医学领域尤其如此。目前对于治疗血栓形成的血管疾病，通过介入技术如支架，导管等来恢复血液的正常流动是主要的治疗手段。然而，介入器材的材料与血液接触后表面引起的不相容以及免疫系统应激反应所导致血栓再形成而引起的血管狭窄或闭塞常常限制了这类介入器材的长期应用。因血栓形成引起血管流通功能紊乱疾病中，由器材介入导致的血栓形成占其中的80%，由此引起的治疗费用超过10亿美元/年。这种副作用所导致的治疗失败直接与血液-生物材料和组织-生物材料表面的不相容性以及生物应激反应相关。血液遇到外源性物质后，体内的凝血系统就会被立即激活。然而，在被内皮细胞覆盖的血管内，血液并不凝结，这主要是由于内皮细胞表面所存在的的一些生物活性分子的存在（主要是血栓调节蛋白，thrombomodulin以及肝磷脂，heparin)抑制了血栓形成的应激反应。随着对内皮细胞抗血拴机理和生物材料血栓形成机制的进一步了解以及医疗技术、纳米技术和表面化学的发展，一些非血栓形成的表面材料模型已被提出，如为增加与血液相容性而直接用磷脂修饰表面材料，特别基于生物膜模拟，利用含磷脂的高分子聚合物或磷脂双层膜修饰生物材料的表面的一些方法已被提出并广为研究。作为细胞膜的主要磷脂成分，磷脂酰胆碱（phosphorylcholine,PC）构成的表面展现了很好的生物兼容性，因为它们不但可以抑制蛋白质的非特异吸附，并且能够提高材料表面所存在生物分子的稳定性。这类磷脂及其高分子聚合物已被用于各种医用生物材料的改性如涤纶（Dacrons），人造血管，聚乙烯人造关节，医用不锈钢针及冠状动脉支架，并在体内显示了良好的血液兼容性和生物相容性。然而,磷脂在材料表面的有序,紧密排列,模拟生物膜的稳定性等一系列问题仍远未解决。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种具有抗血栓形成的生物功能材料，该材料通过化学方法将完整、稳定的脂质体固定于固体材料表面，在特定材料的表面稳定的、排列有序的脂质体覆盖层，利用“点击化学”的选择特异性，进一步用血栓调节蛋白修饰脂质体的表面实现脂质体的功能化，实现模拟内皮细胞的抗血栓功能。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种具有抗血栓再形成功能的生物材料，其特征在于，血栓调节蛋白和凝血酶有较高的亲合性，可以通过形成化学计量1：1复合物而活化C蛋白来完成生物体系由促凝血到抗凝血的转化，先将脂质体修饰到固体材料的表面，改变固体材料表面组成，然后利用“点击化学”将重组的血栓调节蛋白修饰到脂质体的表面，最终形成具有抗血栓再形成功能的生物材料。一种具有抗血栓再形成功能的生物材料，所述脂质体组成的摩尔比为DPPC：胆固醇：DPPE-PEG2000-DBCO=2:1:0.005。一种具有抗血栓再形成功能的生物材料的制备方法，具体包括如以下步骤。1）取叠氮PEG活性脂N3-PEG6-NHS溶解在四氢呋喃中，形成活性脂的四氢呋喃溶液，活性脂浓度为5~10mg/mL。2）将N，N-二异丙基乙胺加入到活性脂的四氢呋喃溶液中，然后加水稀释使得活性脂浓度为3~5mg/mL，N，N-二异丙基乙胺浓度为0.04~0.08ml/mL，将具有氨基表面的固体材料放入到该溶液中，室温下轻轻摇动，反应进行8~12小时后将固体材料取出，淋洗，氮气吹干。3）二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000在氩气保护下溶解在氯仿中，再将DBCO-PEG4-NHS溶解在氯仿中，氩气保护下混合两种液体，所得溶液DSPE-PEG2000-NH2的浓度为20~30mg/mL，DBCO-PEG4-NHS浓度为3.0~8.0mg/mL，室温下搅拌反应10~20分钟后加入三乙胺使其浓度为0.010~0.015ml/mL，45~60小时后反应完成，将所得的混合物纯化后得到DSPE-PEG2000-DBCO。4）脂质体的自组装通过挤压的方式完成，脂质体的大小由最后通过的聚碳酸膜孔径来控制，本专利技术采用直径100nm的质子体，具体操作如下：将DPPC、胆固醇和DSPE-PEG2000-DBCO溶解溶解在氯仿中，DPPC：胆固醇：DSPE-PEG2000-DBCO为1：1：0.01~4：1：0.1，在40-45℃减压蒸馏后在圆底烧瓶壁上得到磷脂膜，真空过夜以完全除去溶剂，将得到的磷脂膜溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中，在液氮和65℃水浴中反复冷冻-溶解10次，所得到的悬浊液分别依次挤压通过聚碳酸脂膜，得到脂质体。5）脂质体固定到固体材料表面：将含有DPPC：CHL：DSPE-PEG2000-DBCO的脂质体用pH为7.4的PBS缓冲液稀释到2.0mg/ml，与叠氮化的固体材料在室温下反应2~4小时，通过“点击化学”脂质体固定到固体材料表面形成3D结构的表面，反应结束后移去溶液以及未反应的脂质体，固体材料用PBS缓冲液清洗3次。6）血栓调节蛋白的重组：含有血栓调节蛋白EDF-4、EGF-5和EGF-6部分氨基酸序列349-492，其中388序列的蛋氨酸被亮氨酸取代，氮端和碳端含有BamHI内切酶，并且碳端连接有甘氨酸GlyGlyMet做为变异的定向位点首先被嵌入到载体质粒pET-39b(+)中，将含有血栓调节蛋白的载体质粒pET-39b(+)转入到大肠杆菌蛋氨酸营养缺陷型感受细胞B834(DE3)中，向M9基本培养液500~1000ml中加入培养过夜约8~12小时的转化细胞20~40ml，当培养液的浊度OD600达到0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG使其浓度为0.5~1.0mM，5分钟后，中间产物交换以移去蛋氨酸，在3000~6000g条件下将细胞沉淀离心15~30分钟，弃去上清液，细胞用M9培养液清洗后，溶解在500~1000mlM9培养液中再次形成悬浊液，此M9培养液不含蛋氨酸，取而代之的是50~150mg叠氮丙氨酸，溶液在37ºC下培养5小时，得到蛋白TM1，其氮端连接二硫键还原酶Dsba和S-tags，4-20%的SDS-PAGE梯度凝胶电泳可对蛋白进行分析；并用S-tag快速分析定量所表达蛋白的产率，所得蛋白TM1用金属亲和色谱通过TALON树脂进行纯化，最后利用肠激酶裂解移去结合的tag，得到目标蛋白TM2。7）用PBS缓冲液在pH7.4下将TM2配成1.0nM的溶液，与用含有DSPE-PEG2000-DBCO质体修饰的固体材料在室温下培养2~6小时，反应结束，固体材料用PBS缓冲液清洗得到目标材料。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果。本专利技术是利用“点击化学”将脂质体完整、稳定的固定于固体材料表面，而生物活性分子通过与脂质体表面特定官能团的特异反应被修饰到材料表面，利用生物分子的生物活性提高生物材料与血液以及组织的相容性，达到降低免疫系统应激反应和抑制血栓形成的作用。这一目标是通过两个平行操作完成，“脂质体完整、稳定的固定”和“生物膜模拟的功能化”。其特点是首先，由脂质体覆盖的材料表面模拟了生物膜表面磷指非特异吸附的特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有抗血栓再形成功能的生物材料，其特征在于，血栓调节蛋白和凝血酶有较高的亲合性，可以通过形成化学计量1：1复合物而活化C蛋白来完成生物体系由促凝血到抗凝血的转化，先将脂质体修饰到固体材料的表面，改变固体材料表面组成，然后利用“点击化学”将重组的血栓调节蛋白修饰到脂质体的表面，最终形成具有抗血栓再形成功能的生物材料。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗血栓再形成功能的生物材料，其特征在于，血栓调节蛋白和凝血酶有较高的亲合性，可以通过形成化学计量1：1复合物而活化C蛋白来完成生物体系由促凝血到抗凝血的转化，先将脂质体修饰到固体材料的表面，改变固体材料表面组成，然后利用“点击化学”将重组的血栓调节蛋白修饰到脂质体的表面，最终形成具有抗血栓再形成功能的生物材料。2.如权利要求1所述的一种具有抗血栓再形成功能的生物材料，其特征在于，所述脂质体组成的摩尔比为DPPC：胆固醇：DPPE-PEG2000-DBCO=2：1：0.005。3.一种具有抗血栓再形成功能的生物材料的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：1）取叠氮PEG活性脂N3-PEG6-NHS溶解在四氢呋喃中，形成活性脂的四氢呋喃溶液，活性脂浓度为5~10mg/mL；2）将N，N-二异丙基乙胺加入到活性脂的四氢呋喃溶液中，然后加水稀释使得活性脂浓度为3~5mg/mL，N，N-二异丙基乙胺浓度为0.04~0.08ml/mL，将具有氨基表面的固体材料放入到该溶液中，室温下轻轻摇动，反应进行8~12小时后将固体材料取出，淋洗，氮气吹干；3）二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000在氩气保护下溶解在氯仿中，再将DBCO-PEG4-NHS溶解在氯仿中，氩气保护下混合两种液体，所得溶液DSPE-PEG2000-NH2的浓度为20~30mg/mL，DBCO-PEG4-NHS浓度为3.0~8.0mg/mL，室温下搅拌反应10~20分钟后加入三乙胺使其浓度为0.010~0.015ml/mL，45~60小时后反应完成，将所得的混合物纯化后得到DSPE-PEG2000-DBCO；4）脂质体的自组装通过挤压的方式完成，脂质体的大小由最后通过的聚碳酸膜孔径来控制，本发明采用直径100nm的质子体，具体操作如下：将DPPC、胆固醇和DSPE-PEG2000-DBCO溶解溶解在氯仿中，DPPC：胆固醇：DSPE-PEG2000-DBCO为1：1：0.01~4：1：0.1，在40-45℃减压蒸馏后在圆底烧瓶壁上得到磷脂膜，真空过夜以完全除去溶剂，将得到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马勇，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21