本发明专利技术公开了一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法。本发明专利技术以可溶淀粉为主要初始原料，将高温α‑葡聚糖磷酸化酶和高温糖‑1‑磷酸核苷酸化酶分别在大肠杆菌中重组表达，利用表达后的菌体高温全细胞催化合成尿苷二磷酸葡萄糖。在此基础上，将高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中重组表达，偶联上述尿苷二磷酸葡萄糖的合成体系高温全细胞催化合成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，同时在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的合成体系中引入高温NADH氧化酶的全细胞催化体系，构成高温NAD+/NADH循环系统，以减少辅酶NAD+的使用。本发明专利技术利用高温全细胞催化的方式，成功避免合成过程中菌体各种代谢通路的干扰，减少纯化难度。
【技术实现步骤摘要】
一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法
本专利技术涉及了一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法，属于生物合成
技术介绍
在碳水化合物的研究中，结构均一寡糖与糖缀复合物是生物体内重要的信息分子，在生命活动中起着重要的作用。现如今，它们越来越多的被用作生物研究的探针或是药物及疫苗发现的先导化合物，对其合成的研究亦越来越引发人们的关注。化学酶法作为近年来的研究热点，具有高效性和高度的专一性，在合成结构均一寡糖及糖缀复合物中具有巨大的应用潜力。而在这一合成过程中，高能的核苷酸糖类作为单糖的供体底物是不可或缺的。核苷酸糖类作为自然界中单糖活化的高能形式，在Leloir型糖基转移、生物合成、糖基化修饰等多个方面具有重要的应用，其中尤以尿苷二磷酸化的糖类应用较为广泛。尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)作为尿苷二磷酸糖类中最为基础的一员，可以作为多种糖基转移酶的单糖供体底物，可以作为其他尿苷二磷酸糖类例如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸木糖、尿苷二磷酸鼠李糖等等的前体，在生物信号通路、靶点研究等各个方面也发挥着重要的作用。其脱氢而得到的衍生产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)可以用做糖胺聚糖糖链延长的单糖供体，对不同分子量大小的糖胺聚糖的研究具有重要意义。传统的核苷酸糖获取方法耗时长、造价昂贵、操作繁琐，其中，直接提取法来源有限、得率极低，化学合成法因糖类的不均一性限制因素较多，且合成过程中易造成环境污染，酶法合成相对而言专一性高，合成过程高效快速，但酶分子需经纯化，且易失活，对大量制备产物具有一定的局限性。中国专利文献CN104561195A公开了一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法，该方法是在一个体外(细胞外)反应系统中，以尿苷三磷酸(UTP)或其盐(如钠盐)、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶粗酶液和麦芽糊精磷酸化酶粗酶液作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。该制备方法以麦芽糊精作为原料之一，原料成本较高，且需要提取尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶的粗酶液，制备步骤较为复杂。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法，是在传统酶法合成的基础上，利用淀粉作为原料，以酶在大肠杆菌重组表达后的菌体作为催化剂进行高温全细胞催化反应，是一种简便、高效、环保经济的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)及其脱氢衍生物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的生物合成方法。本专利技术的技术方案如下：一种尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法，步骤如下：(1)在反应液中，以可溶性淀粉和磷酸盐为底物，以含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到1-磷酸-葡萄糖(1-P-Glc)；(2)取步骤(1)得到的1-磷酸-葡萄糖(1-P-Glc)，加入无机离子、磷酸二氢钠缓冲液、尿苷三磷酸(UTP)，以含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述可溶性淀粉在反应液中的终浓度为45～55g/L。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述磷酸盐为KH2PO4和K2HPO4，进一步优选的，将KH2PO4和K2HPO4溶解于水中配制成KP溶液，所述KP溶液中PO43-的总浓度为1M，pH为6～7，所述KP溶液中PO43-在反应液中的终浓度为0.2～0.9M；最优选的，所述KP溶液的pH为7，所述KP溶液中PO43-在反应液中的终浓度为0.7M。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的重组大肠杆菌加量为6～7g菌体干重/L反应液。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述生物合成的反应温度为70℃，反应时间大于180min；进一步优选的，反应时间为360min。根据本专利技术优选的，步骤(2)中1-磷酸-葡萄糖(1-P-Glc)在反应体系中终浓度为0.4～0.6g/L。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述无机离子为镁离子，进一步优选的，所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH2PO40.2M，NaOH调节pH6～11；进一步优选的，所述磷酸二氢钠缓冲液的pH为9。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述尿苷三磷酸的终浓度为0.05～3.0mM；进一步优选的，终浓度为2mM。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的重组大肠杆菌的加量为3.0～5.5g菌体干重/L反应液，进一步优选的，加量为4.17g菌体干重/L反应液。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述生物合成的反应温度为70～90℃，反应时间大于60min；进一步优选的，所述生物合成的反应温度为80℃，反应时间为180min。根据本专利技术优选的，所述诱导表达的步骤包括：将含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌或含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃225rpm活化12～14h；将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养，初始OD600值为0.05；37℃225rpm培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，即得含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的重组大肠杆菌或含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的重组大肠杆菌。进一步优选的，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌和含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌由南京金斯瑞公司合成，其中，含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET20b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)；含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET21b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)。进一步优选的，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.1～2.3；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.4～2.6。一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的生物合成方法，包括本专利技术上述的尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法的步骤，还包括以下步骤：在反应液中，以上述生物合成方法得到的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)为底物，加入磷酸二氢钠缓冲液，以含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)；同时利用含有诱导表达好高温NADH氧化酶(TkNOX)的重组大肠杆菌构建高温NAD+/NADH循环系统，消耗氧气推动循环过程，从而使合成体系不需额外加入辅酶NAD+。根据本专利技术优选的，所述尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)在反应液中的终浓度为1.2～1.4g/L。根据本专利技术优选的，所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法，其特征在于，步骤如下：(1)在反应液中，以可溶性淀粉和磷酸盐为底物，以含有诱导表达好高温α‑葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到1‑磷酸‑葡萄糖；(2)取步骤(1)得到的1‑磷酸‑葡萄糖，加入无机离子、磷酸二氢钠缓冲液、尿苷三磷酸，以含有诱导表达好高温糖‑1‑磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖。
【技术特征摘要】
1.一种尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法，其特征在于，步骤如下：(1)在反应液中，以可溶性淀粉和磷酸盐为底物，以含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到1-磷酸-葡萄糖；(2)取步骤(1)得到的1-磷酸-葡萄糖，加入无机离子、磷酸二氢钠缓冲液、尿苷三磷酸，以含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖。2.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步骤(1)中包括以下中的一项多多项：i.所述可溶性淀粉在反应液中的终浓度为45～55g/L；ii.所述磷酸盐为KH2PO4和K2HPO4，进一步优选的，将KH2PO4和K2HPO4溶解于水中配制成KP溶液，所述KP溶液中PO43-的总浓度为1M，pH为6～7，所述KP溶液中PO43-在反应液中的终浓度为0.2～0.9M；iii.所述含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌加量为6～7g菌体干重/L反应液；iv.所述生物合成的反应温度为70℃，反应时间大于180min。3.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步骤(2)中包括以下中的一项或多项：i.所述1-磷酸-葡萄糖在反应体系中终浓度为0.4～0.6g/L；ii.所述无机离子为镁离子，进一步优选的，所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM；iii.所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH2PO40.2M，NaOH调节pH6～11；iv.所述尿苷三磷酸的终浓度为0.05～3.0mM；v.所述含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌的加量为3.0～5.5g菌体干重/L反应液；vi.所述生物合成的反应温度为70～90℃，反应时间大于60min。4.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述诱导表达的步骤包括：将含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌或含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃225rpm活化12～14h；将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养，初始OD600值为0.05；37℃225rpm培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，即得含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌或含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌；其中，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET20b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET21b，所用...
【专利技术属性】
技术研发人员：生举正，徐以泓，孟丹华，
申请(专利权)人：安徽禾庚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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