一种5′‑胞苷酸的酶催化合成工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种5′‑胞苷酸的酶催化合成工艺，包括以下步骤：胞苷的合成：胞嘧啶与D‑核糖在合成酶Ⅰ的催化作用下合成胞苷，将反应所得溶液进行过滤得到胞苷过滤液；5′‑胞苷酸母液的制备：胞苷过滤液中和磷酸二氢钠在合成酶Ⅱ的催化作用下合成5′‑胞苷酸，所得反应液保温搅拌一段时间后过滤得到5′‑胞苷酸母液；5′‑胞苷酸的精提：调节5′‑胞苷酸母液的pH，而后过滤得到5′‑胞苷酸粗品，将5′‑胞苷酸粗品精制得到产品5′‑胞苷酸。本发明专利技术的优点是：可降低5′‑胞苷酸的生产成本；工艺周期较短，可提高5′‑胞苷酸的制备效率；产品5′‑胞苷酸的总收率达到90%以上，含量大于99%；对环境、设备及操作人员均无害。

A 5 'cytidine acid synthesis enzyme catalysis

The invention discloses a 5 'cytidine acid synthesis enzyme, which comprises the following steps: synthesis of cytidine: synthesis of cytidine and D cytosine ribose synthetase 1 under the catalysis in the reaction, the obtained solution is filtered to obtain filtrate cytidine 5'; polycytidylic acid mother liquor preparation: cytidine filtrate neutralization of sodium dihydrogen phosphate synthetase II under the catalysis of the synthesis of 5 'polycytidylic acid, the reaction liquid stirring after a period of time by filtering 5' 5 'cytidylate motherliquid; cytidylate extracts: regulation 5' cytidylate liquor pH, and then filtered to obtain 5 'cytidylate crude. The 5' cytidylate crude refined products of 5 'cytidylate. The invention has the advantages of reducing the cost of the production of 5 'cytidylate; process cycle is short, 5' cytidylate can improve the preparation efficiency; the total yield of product is 5 'cytidylate reached more than 90% of the content is more than 99%; are harmless to the environment, equipment and operating personnel.

【技术实现步骤摘要】
一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺
本专利技术涉及生物化工领域，具体涉及一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺。
技术介绍
5’-胞苷酸为生物细胞内重要的生化物质，参与多种生理生化反应。工业上，5’-胞苷酸主要用于制造胞二磷胆碱、胞苷三磷酸、阿糖胞苷、聚肌胞等药物。近年来，亦可与其它核苷酸配合添加奶粉中，以增强婴儿的免疫力。5’-胞苷酸主要有两种生产方式，1）从RNA（核糖核酸）降解，然后经分离得到；2）从胞苷出发，用化学法在其5’位接上磷酸集团，形成5’-胞苷酸。第一种方法虽然一次可以得到四种产物，但除了胞苷酸之外，其它三种均成为副产物,再者RNA来源所受限制较多，且生产工艺中分离操作复杂，收率低；目前工业上合成5’-胞苷酸主要使用化学法，该方法主要缺点在于原料成本高，三废较多，腐蚀设备且不利于人员身体健康及工业化生产。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺，该合成工艺以胞嘧啶、D-核糖和磷酸二氢钠为原料，在合成酶的作用下反应得到5′-胞苷酸，所需原料来源广泛，价格便宜，且反应过程温和，不会对反应设备和操作人员产生不利因素。本专利技术采用的技术方案是：一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺，包括以下步骤：a、胞苷的合成：将胞嘧啶与D-核糖加入到纯水中，调节温度及pH，而后加入合成酶Ⅰ，胞嘧啶与D-核糖在合成酶Ⅰ的作用下催化合成胞苷，该反应在液谱检测胞嘧啶消失时终止，反应终止后将反应所得溶液进行过滤得到胞苷过滤液；b、5′-胞苷酸母液的制备：向胞苷过滤液中加入合成酶Ⅱ和磷酸二氢钠，调节温度及pH，胞苷过滤液和磷酸二氢钠在合成酶Ⅱ的作用下催化合成5′-胞苷酸，液谱检测胞苷消失时反应终止，所得反应液保温搅拌一段时间后过滤得到5′-胞苷酸母液；c、5′-胞苷酸的精提：直接调节5′-胞苷酸母液的pH，而后过滤得到5′-胞苷酸粗品，将5′-胞苷酸粗品精制得到产品5′-胞苷酸。进一步的，所述步骤a，胞苷的合成反应及步骤b5′-胞苷酸母液的制备中温度均为37-39℃，pH均为6.7-7.0。进一步的，所述合成酶Ⅰ的用量为所述胞嘧啶用量的0.5-1.0倍，所述合成酶Ⅱ的用量为所述胞嘧啶用量的1.0-2.0倍。进一步的，所述步骤b，5′-胞苷酸母液的制备反应中所述反应液需在45℃保温搅拌1-3小时。进一步的，所述步骤c，5′-胞苷酸的制备过程中调节所述5′-胞苷酸母液的pH至1-3。进一步的，所述5′-胞苷酸的总收率达到90%以上，纯度大于99%。进一步的，所述步骤a中需加入少量PEG400作为相转移催化剂。进一步的，所述胞嘧啶、D-核糖、PEG400、磷酸二氢钠和纯水的用量以重量份计：胞嘧啶111.10份、D-核糖150.13份、PEG4000.11份、磷酸二氢钠240份及纯水600份。进一步的，所述合成酶Ⅰ包括胞苷连接酶和NAD+，所述NAD+的含量为所述胞苷连接酶含量的0.01%-0.02%，所述合成酶Ⅱ包括胞苷激酶和ATP,所述ATP的含量为所述胞苷激酶含量的0.1%-0.5%。本专利技术的有益效果是：1、所需原料胞嘧啶、D-核糖和磷酸二氢钠来源广泛、价格便宜，所需合成酶可循环利用，因而可大大降低5′-胞苷酸的生产成本；2、只需两个酶催化反应和一个精提步骤即可得到产品5′-胞苷酸，工艺周期较短，可有效提高5′-胞苷酸的制备效率；3、产品5′-胞苷酸的总收率达到90%以上，含量大于99%，酶催化反应作用大大提高了转化效率；4、酶催化反应反应过程较为温和，对环境、设备及操作人员均无害。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的保护范围的限定。实施例1a、胞苷的合成：取1000ml四口烧瓶，加入111.10g胞嘧啶、150.13gD-核糖、600g纯水及0.11gPEG400，将四口烧瓶固定放置到恒温搅拌器上，开始搅拌并调节恒温搅拌器的温度至37-39℃，调节四口烧瓶中混合液的pH至6.7，而后向四口烧瓶中加入55.6g合成酶Ⅰ，合成酶Ⅰ包括胞苷连接酶和NAD+，NAD+的含量为胞苷连接酶含量的0.01%-0.02%,保温搅拌，每隔一小时从四口烧瓶中取出样品进行液谱分析，当液谱检测胞嘧啶完全反应掉时，反应终止，将四口烧瓶中反应所得溶液进行过滤，滤饼用200g纯水进行漂洗，将所得滤液和漂洗液合并在一起，即为胞苷过滤液；b、5′-胞苷酸母液的制备：将1000ml四口烧瓶洗净，倒入步骤a所得胞苷过滤液，固定放置到恒温搅拌器上，调节恒温搅拌器温度至37-39℃，向四口烧瓶中加入240g磷酸二氢钠，搅拌溶解，调节四口烧瓶中的液体pH至6.7，而后加入111g合成酶Ⅱ，合成酶Ⅱ包括胞苷激酶和ATP,ATP的含量为胞苷激酶含量的0.1%-0.5%,保温搅拌，每隔一小时从四口烧瓶中取出样品进行液谱分析，当液谱检测胞苷完全反应掉时，反应终止，调节恒温搅拌器温度至45℃，保温搅拌1小时，将四口烧瓶中的反应液进行过滤，滤饼用200g纯水进行漂洗，将所得滤液和漂洗液合并在一起，即为5′-胞苷酸母液；c、5′-胞苷酸的精提：调节步骤b所得5′-胞苷酸母液的pH至2.5，降温至0℃，保温一小时，过滤得到306.5g5′-胞苷酸粗品，再精制后得到292.1g产品5′-胞苷酸。产品5′-胞苷酸的收率为90.38%，含量为99.21%。实施例2a、胞苷的合成：取1000ml四口烧瓶，加入111.10g胞嘧啶、150.13gD-核糖、600g纯水及0.11gPEG400，将四口烧瓶固定放置到恒温搅拌器上，开始搅拌并调节恒温搅拌器的温度至37-39℃，调节四口烧瓶中混合液的pH至7.0，而后向四口烧瓶中加入55.6g合成酶Ⅰ，合成酶Ⅰ包括胞苷连接酶和NAD+，NAD+的含量为胞苷连接酶含量的0.01%-0.02%,保温搅拌，每隔一小时从四口烧瓶中取出样品进行液谱分析，当液谱检测胞嘧啶完全反应掉时，反应终止，将四口烧瓶中反应所得溶液进行过滤，滤饼用200g纯水进行漂洗，将所得滤液和漂洗液合并在一起，即为胞苷过滤液；b、5′-胞苷酸母液的制备：将1000ml四口烧瓶洗净，倒入步骤a所得胞苷过滤液，固定放置到恒温搅拌器上，调节恒温搅拌器温度至37-39℃，向四口烧瓶中加入240g磷酸二氢钠，搅拌溶解，调节四口烧瓶中的液体pH至7.0，而后加入111g合成酶Ⅱ，合成酶Ⅱ包括胞苷激酶和ATP,ATP的含量为胞苷激酶含量的0.1%-0.5%,保温搅拌，每隔一小时从四口烧瓶中取出样品进行液谱分析，当液谱检测胞苷完全反应掉时，反应终止，调节恒温搅拌器温度至45℃，保温搅拌1小时，将四口烧瓶中的反应液进行过滤，滤饼用200g纯水进行漂洗，将所得滤液和漂洗液合并在一起，即为5′-胞苷酸母液；c、5′-胞苷酸的精提：调节步骤b所得5′-胞苷酸母液的pH至2.5，降温至0℃，保温一小时，过滤得到306.7g5′-胞苷酸粗品，再精制后得到287.16g产品5′-胞苷酸。产品5′-胞苷酸的收率为90.07%，含量为99.21%。实施例3a、胞苷的合成：取1000ml四口烧瓶，加入111.10g胞嘧啶、150.13gD-核糖、600g纯水及0.11gPEG400，将四口烧瓶固定放置到恒温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种5′‑胞苷酸的酶催化合成工艺，其特征在于，包括以下步骤：a、胞苷的合成：将胞嘧啶与D‑核糖加入到纯水中，调节温度及pH，而后加入合成酶Ⅰ，胞嘧啶与D‑核糖在合成酶Ⅰ的作用下催化合成胞苷，该反应在液谱检测胞嘧啶消失时终止，反应终止后将反应所得溶液进行过滤得到胞苷过滤液；b、5′‑胞苷酸母液的制备：向胞苷过滤液中加入合成酶Ⅱ和磷酸二氢钠，调节温度及pH，胞苷过滤液和磷酸二氢钠在合成酶Ⅱ的作用下催化合成5′‑胞苷酸，液谱检测胞苷消失时反应终止，所得反应液保温搅拌一段时间后过滤得到5′‑胞苷酸母液；c、5′‑胞苷酸的精提：直接调节5′‑胞苷酸母液的pH，而后过滤得到5′‑胞苷酸粗品，将5′‑胞苷酸粗品精制得到产品5′‑胞苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺，其特征在于，包括以下步骤：a、胞苷的合成：将胞嘧啶与D-核糖加入到纯水中，调节温度及pH，而后加入合成酶Ⅰ，胞嘧啶与D-核糖在合成酶Ⅰ的作用下催化合成胞苷，该反应在液谱检测胞嘧啶消失时终止，反应终止后将反应所得溶液进行过滤得到胞苷过滤液；b、5′-胞苷酸母液的制备：向胞苷过滤液中加入合成酶Ⅱ和磷酸二氢钠，调节温度及pH，胞苷过滤液和磷酸二氢钠在合成酶Ⅱ的作用下催化合成5′-胞苷酸，液谱检测胞苷消失时反应终止，所得反应液保温搅拌一段时间后过滤得到5′-胞苷酸母液；c、5′-胞苷酸的精提：直接调节5′-胞苷酸母液的pH，而后过滤得到5′-胞苷酸粗品，将5′-胞苷酸粗品精制得到产品5′-胞苷酸。2.根据权利要求1所述的一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺，其特征在于，所述步骤a，胞苷的合成反应及步骤b5′-胞苷酸母液的制备中温度均为37-39℃，pH均为6.7-7.0。3.根据权利要求1所述的一种5′-胞苷酸的酶催化合成工艺，其特征在于，所述合成酶Ⅰ的用量为所述胞嘧啶用量的0.5-1.0倍，所述合成酶Ⅱ的用量为所述胞嘧啶用量的1.0-2.0倍。4.根据权利要求1所述的一种5′-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张剑，刘拥军，于广，张玮琪，张军，
申请(专利权)人：南通香地生物有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32