一种杨树质体表达系统的建立方法技术方案

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种杨树质体表达系统的建立方法，利用这个表达系统成功表达了绿色荧光蛋白GFP基因(gfp)，首先，建立了山新杨高效叶片再生体系，然后利用多种分子生物学技术构建了杨树质体转化载体。本发明专利技术经Southern blot分析证实GFP基因导入质体基因组中，而且达到了同质化，Northern bolt分析显示了GFP基因的转录水平，Western blot分析表明了绿色荧光蛋白在杨树质体中成功表达，从而为杨树质体基因工程的研究和杨树新品种的开发奠定了坚实的基础。

Establishment of a Poplar Plasmid Expression System

The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses a method for establishing a poplar plastid expression system. The green fluorescent protein GFP gene (gfp) is successfully expressed by the expression system. Firstly, an efficient leaf regeneration system of Populus davidiana is established, and then a poplar plastid transformation vector is constructed by using various molecular biological techniques. Southern blot analysis confirmed that the GFP gene was introduced into the plastid genome and reached homogeneity. Northern bolt analysis showed the transcription level of the GFP gene. Western blot analysis showed that the green fluorescent protein was successfully expressed in the plastid of poplar, which laid a solid foundation for the research of poplar plastid genetic engineering and the development of new poplar varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种杨树质体表达系统的建立方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种杨树质体表达系统的建立方法。具体包括杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体的建立和杨树质体基因枪转化方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：杨树是一种重要的经济林木和模式木本植物。山新杨是一种优良的杨树品种，它以采自嫩江县高峰林场山杨为母本，父本新疆杨来源于乌鲁木齐，于1964年进行杂交组合，经20年栽培试验，表现良好，性状稳定。适应性强，抗逆性好，常用于防风固沙。树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，20年生树皮尚未开裂，果序自然脱落且不飞絮。近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，而山新杨的繁殖是无性繁殖，不飞絮等特点，使其质体转基因更安全。杨树作为用材林、防护林和四旁绿化的主要树种，但是目前危害杨树的病虫害种类很多，严重危害了杨树的正常生长。用质体转基因技术转抗虫基因、抗病基因和抗逆基因到杨树质体中，既能够达到相应的抗性效果,又增加了生物安全性。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中，没有建立成熟的杨树质体表达系统。虽然在2006年，Okumura等人在银白杨(Populusalba)中表达了绿色荧光蛋白报告基因，但是10几年过去了，再也没有关于杨树质体转化方面的报道，也就是没有建立成熟稳定的杨树质体转化系统。(2)杨树是木本植物，多数木本植物的再生较为困难，而用于杨树质体转化的材料再生更困难。(3)没有适合用于杨树质体转化的较为完善的转化方法。(4)没有用于山新杨质体转化的质体转化载体。解决上述技术问题的意义：经过多年的研究，本专利技术寻找到了山新杨质体转化的叶片再生体系，构建了山新杨质体转化载体和建立并优化了杨树基因枪转化方法，从而为杨树质体转基因成功奠定了坚实的基础，杨树质体转基因的再次成功为杨树质体转抗虫基因、抗病基因和抗逆基因奠定坚实的基础，并为杨树品种的改良提供一种有效的途径。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种杨树质体表达系统的建立方法。本专利技术的目的是建立成熟的杨树质体表达系统，包括杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体和杨树质体基因枪转化方法。为杨树质体基因工程研究和应用提供有效的工具。本专利技术是这样实现的，专利技术提出了一种杨树质体表达系统的建立方法，包括杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体和杨树质体基因枪转化方法。从而为杨树质体转抗虫基因、抗病基因和抗逆基因和杨树品种的改良奠定坚实的基础。具体包括：步骤1、山新杨高效叶片再生体系的建立选取健壮的无菌山新杨(PopulusdavidianaxP.bolleana)幼嫩叶片，在叶片再生培养基PaSIM2中培养，把丛生芽转移至快繁培养基(同生根培养基)中培养，当组培苗生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取顶端3-4个结节长度的茎段再放入生根培养基中生长，当此组培苗生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取杨树组培苗顶端的第2-3片叶片作为转化的叶片材料。培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：30-40μE·m-2·s-1。此杨树组培苗顶端的第2-3片叶片切成3mm*3mm大小的方块，转入叶片再生培养基PaSIM1中再生，叶片的再生率为100％，每个愈伤方块上丛生芽增殖数约为90.97个。步骤2、山新杨质体转化载体的构建以去除多克隆位点的质粒pBluescriptIIks(+)为载体骨架(SEQ:ID:NO:1)，把克隆的山新杨质体基因组中的左同源序列(SEQ:ID:NO:2)、右同源序列(SEQ:ID:NO:3)、烟草质体转化载体pYY12的中的aadA表达盒和gfp表达盒(SEQ:ID:NO:4)克隆到去除多克隆位点的质粒pBluescriptIIks(+)中，构建了杨树质体转化载体pYY20。步骤3、杨树质体基因枪转化体系的建立首先把叶片材料置于渗透培养基PaOM中进行黑暗培养24小时之后，用金粉包裹杨树质体转化载体pYY20质粒DNA，通过基因枪轰击叶片转化法，利用步骤1中高效的叶片再生体系，在含有30mg/L壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选抗性芽，培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：20-25μE·m-2·s-1。6次轰击得到了8个阳性苗，把得到的抗性芽转入含有30mg/L壮观霉素的PaSIM2培养基上，再经过2-3轮的叶片再生之后，Southernbolt鉴定同质化抗性苗，从而得到同质化的转基因杨树组培苗。步骤4、转基因杨树的炼苗和移栽把得到的同质化转基因杨树组培苗移入土培基质(土培基质配方为：蛭石:草炭土:珍珠岩＝5:3:2)中，并在人工气候箱培养1-2个月，然后经过炼苗后，转入温室进行逐渐增强光照强度和降低湿度的培养，最后移栽到户外田间栽培培养。步骤5绿色荧光蛋白GFP基因在杨树质体中转录与表达Northernbolt分析显示了GFP基因的转录水平，Westernblot分析表明了绿色荧光蛋白GFP基因在杨树质体中成功表达。本专利技术的杨树质体表达系统的建立的亮点之一，是重现杨树质体转化，并且可以重复，并且也转化了其他基因，如抗虫基因，再就是本专利技术用的品种和现有技术中原先发表的用的杨树的品种不同，现有技术用的银白杨，本专利技术用的是山新杨。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术利用这个表达系统成功表达了绿色荧光蛋白GFP基因(gfp)。在山新杨质体转化中，基因枪轰击4次，得到了23个抗性芽，经Southernblot鉴定后，阳性芽为8个，阳性率为34.78％。而在2006年，Okumura等发表的文献中报道的银白杨质体转化中，基因枪轰击8次，得到了106个抗性芽，经Southernblot鉴定后，阳性芽为21个，阳性率为19.81％。我们转化山新杨后得到的阳性芽阳性率比银白杨的阳性率高，但是因为品种不同，没有可比性。但是，本专利技术利用山新杨质体转化系统，本专利技术又成功转化了Bt蛋白基因，并成功得到了同质化的抗虫杨树，说明本专利技术这个系统是成熟的，而且是稳定的，阳性苗移栽后成活率为100％。从而为杨树质体基因工程的研究和杨树新品种的开发奠定了坚实的基础。附图说明图1为本专利技术实施例提供的杨树转化载体pYY20构建图。图2为本专利技术实施例提供的杨树质体转GFP基因同质化阳性苗的验证及GFP基因在质体中的转录和表达图。图中：A：野生型杨树基因组和转GFP基因杨树基因组图；B：Southernblot图；C：Northernblot图；D：Westernblot图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。现有技术中，没有建立成熟的杨树质体表达系统,没有利用杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体和杨树质体基因枪转化方法为杨树的质体基因工程研究和应用提供有效的工具。下面结合具体分析对本专利技术的应用作进一步描述。本专利技术实施例提供的杨树质体表达系统的建立方法，包括以下步骤：步骤1、山新杨高效叶片再生体系的建立选取健壮的无菌山新杨(PopulusdavidianaxP.bo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杨树质体表达系统的建立方法，其特征在于，所述杨树质体表达系统的建立方法包括：第一步，建立山新杨高效叶片再生体系；第二步，利用多种分子生物学技术构建杨树质体转化载体，所述载体以去除多克隆位点的质粒pBluescript II ks(+)载体为骨架；利用金粉包裹pYY20质粒DNA通过基因枪法导入山新杨质体基因组中，经轰击后，在含30mg/L的壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选多个阳性抗性苗；第三步，阳性抗性苗叶片在含30mg/L的壮观霉素的PaSIM2培养基上经过再生后，分析GFP基因是否导入质体基因组中，是否达到同质化。

【技术特征摘要】
1.一种杨树质体表达系统的建立方法，其特征在于，所述杨树质体表达系统的建立方法包括：第一步，建立山新杨高效叶片再生体系；第二步，利用多种分子生物学技术构建杨树质体转化载体，所述载体以去除多克隆位点的质粒pBluescriptIIks(+)载体为骨架；利用金粉包裹pYY20质粒DNA通过基因枪法导入山新杨质体基因组中，经轰击后，在含30mg/L的壮观霉素的PaSIM1培养基上筛选多个阳性抗性苗；第三步，阳性抗性苗叶片在含30mg/L的壮观霉素的PaSIM2培养基上经过再生后，分析GFP基因是否导入质体基因组中，是否达到同质化。2.如权利要求1所述的杨树质体表达系统的建立方法，其特征在于，第一步中，山新杨高效叶片再生体系的建立方法包括：选取健壮的无菌山新杨幼嫩叶片，在叶片再生培养基PaSIM2中培养，把丛生芽转移至快繁培养基中培养，当组培苗生长4周时，选取顶端3-4个结节长度的茎段再放入生根培养基中生长，当此组培苗生长4周时，选取杨树组培苗顶端的第2-3片叶片作为转化的叶片材料；培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：30-40μE·m-2·s-1；此杨树组培苗顶端的第2-3片叶片切成3mm*3mm大小的方块，转入叶片再生培养基PaSIM1中再生。3.如权利要求1所述的杨树质体表达系统的建立方法，其特征在于，第二步中，山新杨质体转化载体的构建方法包括：以去除多克隆位点的质粒pBluescriptIIks(+)SEQ:ID:NO:1为载体骨架，把克隆的山新杨质体基因组中的左同源序列SEQ:ID:NO:2、右同源序列SEQ:ID:NO:3、烟草质体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张江，武玉永，有利利，马美琪，常玲，李圣纯，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42