一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法技术

本发明专利技术涉及一种选育抗辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)烟草植物的方法，将烟草植物包含的eIFiso4E‑S基因敲除(Knockout,KO)，获得eifiso4e‑s

A Method for Breeding Tobacco Plants Resistant to Pepper Vein Mottle Virus

The present invention relates to a method for selecting and breeding tobacco plants resistant to chili vein mottle virus (ChiVMV). The eIFiso4E_S gene contained in tobacco plants is knocked out (KO) to obtain eifiso4e_s.

【技术实现步骤摘要】
一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法
本专利技术属于生物
，进一步属于烟草生物技术育种领域，具体涉及一种聚合eIFiso4E-S基因突变体和eIF4E1基因突变体、获得抗辣椒脉斑驳病毒的烟草植物的方法。
技术介绍
辣椒脉斑驳病毒(Chilliveinalmottlevirus,ChiVMV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的成员，主要危害烟草、番茄和辣椒等茄科(Solanaceae)作物，近年来已经上升为烟草上的常见病害。ChiVMV在田间由蚜虫非持久性传播。由于蚜虫发育周期短、繁殖力强和易产生抗药性，利用化学药剂防治媒介昆虫来治理该病害效果有限，因此，选育ChiVMV抗病品种依然是防控ChiVMV最根本、最经济有效的手段，但迄今烟草中未见抗ChiVMV的资源报道。真核生物翻译起始因子(eukaryoticinitiationfactors4E,eIF4E)或其异构体(Isoforms)是植物中主要的隐性抗病基因。在14个植物隐性抗病毒病基因中，有12个编码eIF4E或eIF(iso)4E(Wangandkrishnaswamy,2012)。eIF4E家族中特定蛋白的缺失或关键氨基酸改变，可赋予植物对病毒的抗性(Ruffel,2002)。已有的研究表明，potyviruses的VPg蛋白能够特异的结合植株中eIF4E和(或)eIF(iso)4E，通过与eIF4E互作来起始病毒RNA的翻译(Léonard等，2000)。但不同potyviruses利用eIF4E基因家族的成员可能相同也可能不同，且不同potyviruses利用eIF4E基因家族的成员的数量也会有所差别。例如在辣椒中，eIF4E基因(pvr2)的敲除赋予植物PVY和TEV的抗性，而只有同时敲除eIF4E基因(pvr2)和eIF(iso)4E基因(pvr6)才能获得针对ChiVMV的抗性(Ruffel等，2004)。这表明在植物和病毒的相互作用中，这两种同源异构体没有功能上地重叠，而是在共同的进化中，形成了各不相同的选择关系。本专利技术申请人及Julio等表明烟草eIF4E1基因(有的文献缩写为eIF4E-1，GenBank序列登录号KF155696)缺失或突变导致烟草产生针对PVY的抗性(刘勇等，2013；Julio等，2014)。但利用缺失eIF4E1基因的普通烟草(va)进行抗病谱鉴定时发现ChiVMV仍能成功侵染，因此申请人提出如下假说：在缺失eIF4E1基因的普通烟草(va)中，ChiVMV与烟草eIF4E家族某个成员互作，完成侵染循环，同时敲除eIF4E1和该成员有望获得ChiVMV抗性的育种材料。本专利技术聚合eif4e1突变材料和eifiso4e-s突变材料，获得了新抗ChiVMV基因资源和抗病材料。本专利技术亦可对茄科作物马铃薯、辣椒、番茄抗ChiVMV育种具有重要的借鉴作用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种获得对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法。本专利技术目的通过以下三个步骤实现：A步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)的材料。B步骤：通过基因编辑、物理诱变、化学诱变、种质资源筛选、基因人工合成、基因表达干涉等方法，获得eIF4E1敲除(eif14e1KO)的材料。C步骤：将上述A步骤获得的材料与上述B步骤获得的材料聚合，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)与eIF4E1敲除(eif14e1KO)的聚合的各种组合。优选的应用途径为：(1)在上述A步骤获得的材料的基础上，获得上述B步骤的目标材料；或者在上述B步骤获得的材料的基础上，获得上述A步骤的目标材料。(2)分别获得上述A步骤的目标材料、B步骤的目标材料，然后利用杂交育种、体细胞杂交等方式聚合，获得eIFiso4E-S敲除(eifiso4e-sKO)与eIF4E1敲除(eif14e1KO)的聚合的各种组合。进一步优选的应用途径为：(1)在eIF4E1敲除(eif4e1KO)的基础上，通过基因编辑、化学诱变、物理诱变得到含eifiso4e-sKOeif4e1KO基因的烟草植株；(2)在eIF4E1敲除(eif4e1KO)的基础上，确定与ChiVMV的VPg的特定氨基酸互作的eIFiso4E-S的特定氨基酸，利用生物技术，包括基因编辑、导入人工合成基因、突变体筛选，将能与ChiVMV的VPg的特定氨基酸互作的eIFiso4E-S的特定氨基酸转换为不能互作的氨基酸，获得含eifiso4e-sKOeif4e1KO基因的烟草植株。(3)从烟草属植物中筛选获得包含eifiso4e-sKO基因的种质资源；所述的种质资源包含烟草野生种、栽培种、以及野生种与栽培种的杂交种。然后，通过eifiso4e-sKO种质资源植株与eif4e1KO植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-sKOeif4e1KO基因的烟草植株。(4)在eIF4E1功能正常的基础上，通过基因编辑、化学诱变、物理诱变得到含eifiso4e-sKO基因的烟草植株；然后，通过eifiso4e-sKO植株与eif4e1KO植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-sKOeif4e1KO基因的烟草植株。(5)在eIF4E1功能正常的基础上，利用生物技术，包括基因编辑、突变体筛选，将能与ChiVMV的VPg的特定氨基酸互作的eIFiso4E-S的特定氨基酸转换为不能互作的氨基酸，然后，通过eifiso4e-sKO植株与eif4e1KO植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-sKOeif4e1KO基因的烟草植株。(6)从烟草属植物中筛选获得包含eif4e1KO基因的种质资源；所述的种质资源包含烟草野生种、栽培种、以及野生种与栽培种的杂交种。然后，通过eifiso4e-sKO种质资源植株与eif4e1KO植株杂交、回交等育种手段，获得含eifiso4e-sKOeif4e1KO基因的烟草植株。利用上述具有抗性的eifiso4e-sKOeif4e1KO烟草材料选育抗ChiVMV的烟草品种。根据所述获得对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植株的方法，可以得到新的抗ChiVMV烟草品种、及其种子和无性繁殖体。另外，还可以开发一些基因工程产品，包括A:所述eIFiso4E-S基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。B:包括所述eIF4E1基因Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。C:A和B的组合。D:所述eIFiso4E-S基因和eIF4E1基因同时Knockout的表达盒，转基因细胞系和重组菌等。利用上述基因工程产品使烟草获得对ChiVMV的抗性。定义：基因敲除：geneknockout(简写:KO)，指利用遗传操作技术使生物体的一个或多个基因失去功能。基因敲除的方法有同源重组(homologousrecombination)和位点特异性核酸酶技术(site-specificnucleases)。位点特异性核酸酶技术包括锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-l本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得抗辣椒脉斑驳病毒的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法向烟草基因组引入至少2种真核生物翻译起始因子(eIF4E)家族基因中各至少一种等位基因内的突变，所述突变降低真核生物翻译起始因子的表达或功能，且其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第一种基因编码eIFiso4E‑S多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第二种基因编码eIF4E1多肽，其中：a)所述eIFiso4E‑S基因的所述突变导致所述eIFiso4E‑S多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E‑S基因突变发生于编码SEQ ID NO:2多肽的外显子区域。b)所述eIF4E1基因的所述突变导致所述eIF4E1多肽缺失，所述突变导致包含SEQ ID NO:3核苷酸的序列缺失。

【技术特征摘要】
1.一种获得抗辣椒脉斑驳病毒的烟草植物的方法，其特征在于，所述方法向烟草基因组引入至少2种真核生物翻译起始因子(eIF4E)家族基因中各至少一种等位基因内的突变，所述突变降低真核生物翻译起始因子的表达或功能，且其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第一种基因编码eIFiso4E-S多肽，其中所述真核生物翻译起始因子家族基因的第二种基因编码eIF4E1多肽，其中：a)所述eIFiso4E-S基因的所述突变导致所述eIFiso4E-S多肽翻译提前终止或阅读框移码或氨基酸转换，所述eIFiso4E-S基因突变发生于编码SEQIDNO:2多肽的外显子区域。b)所述eIF4E1基因的所述突变导致所述eIF4E1多肽缺失，所述突变导致包含SEQIDNO:3核苷酸的序列缺失。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述eIFiso4E-S基因突变发生于SEQIDNO:1所示区域，所述编号的依据是SEQIDNO:1，选自以下组：a)第11位增加核苷酸A；(2-1398g1-2D)b)第99位增加核苷酸A；(Y87g2-4A)c)在靶位点增加1-n个碱基、删除1-n个碱基，n为2至10的整数；d)碱基替换导致氨基酸转换。e)其任意组合。3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述eIF4E1基因突变对应SEQIDNO:4核苷酸位置，选自以下组：a)包含SEQIDNO:4的核苷酸序列缺失(va)b)第105位核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，黄昌军，于海芹，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53