一种烟草高通量遗传转化的方法技术

本发明专利技术涉及一种烟草高通量遗传转化的方法，属于植物遗传转化领域。该方法包含烟草无菌苗培育、侵染农杆菌制备、侵染、共培养、选择和分化培养以及生根培养。本发明专利技术去掉了费时、费力的烟草叶盘预培养，侵染农杆菌活化、共培养后清洗等步骤，节约了人力和时间成本，降低了转化过程中由于繁锁的人工操作带来的污染风险，同时遗传转化效率进一步提高，适合烟草的规模化遗传转化。

A High-throughput Genetic Transformation Method for Tobacco

The invention relates to a method for high-throughput genetic transformation of tobacco, belonging to the field of plant genetic transformation. The method includes cultivation of tobacco aseptic seedlings, preparation of infective Agrobacterium tumefaciens, infection, co-culture, selection and differentiation culture, and rooting culture. The invention eliminates the time-consuming and laborious steps of tobacco leaf disc pre-culture, the activation of Agrobacterium infection and the cleaning after co-culture, saves human and time costs, reduces the pollution risk caused by the complicated manual operation in the transformation process, and further improves the efficiency of genetic transformation, which is suitable for the large-scale genetic transformation of tobacco.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草高通量遗传转化的方法
本专利技术涉及一种遗传转化的方法，具体涉及一种烟草高通量遗传转化的方法，属于植物遗传转化领域。
技术介绍
普通烟草（Nicotianatabacum）是茄科模式生物，在模式生物基础研究和国民经济生产中都发挥着重要作用。同时，烟草也是一种最早进行组织培养的植物，根据烟草开发的MS基本培养基（MurashigeandSkoog，1962）已在上百种植物的组织培养中得到广泛应用。虽然具有先发优势，烟草基因研究却一直存在基础薄弱、规模弱小的局限。近年来，基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术（以下称基因编辑技术）横空出世，它原理简单、突变高效、成本低廉、应用广泛，在生命科学领域掀起一场技术革命，给基因功能研究和种业不断带来新的突破，比如：在美国，科学家通过编辑PPO基因创制防褐化蘑菇；在日本，科学家通过编辑SSR2基因创制生芽却不含毒素的土豆新品种；在中国，科学家分别通过编辑MLO和OsBADH2基因创制抗白粉病小麦和香稻新品种。基因编辑技术的发展和成熟也给烟草基因研究带来新的机遇。最近几年，随着烟草基因编辑技术的建立，研究规模不断升级，规模化遗传转化技术也成为新的挑战。经过几十年的技术积累，总体来看，烟草已经形成一套包括无菌苗培养、农杆菌划线、农杆菌单克隆液体活化培养、叶盘预培养、侵染、共培养、共培养叶盘清洗、选择和分化培养、生根培养等九个步骤的稳定遗传转化体系，但由于过去研究规模过小的原因，烟草遗传转化过程中操作步骤和培养基种类繁多、耗费人力、时间漫长等缺点也一直存在，目前越来越需要一种简单、高效、低人力资源，适合规模化操作的烟草遗传转化技术。
技术实现思路
为解决上述问题，适应规模化操作的需求，本专利技术构建了一种烟草高通量遗传转化的方法。本专利技术的目的在于利用根瘤农杆菌介导的方法，创建一种高通量的遗传转化技术，摆脱烟草没有规模化遗传转化方法的限制，加快烟草基因研究的速度，提高烟草基础研究的整体水平。本专利技术的具体技术方案如下：一种烟草高通量遗传转化的方法，包括如下步骤：步骤（1）烟草无菌苗培育：取饱满的烟草种子，在超净工作台中分别经酒精和次氯酸钠消毒后接种到无抗MS培养基中，20-25℃下培养30-40天获得无菌苗植株。步骤（2）侵染农杆菌制备：取出预先冻存的农杆菌，融化后吸取50-200ul均匀涂布到包含相应抗生素的YEB固体抗性培养基中，28℃下培养48-72小时后从培养箱中取出移至超净工作台，用移液器吸取无抗MS液体培养基反复吹打菌体，将培养基与菌体的混合液转移至离心管中，摇匀，取无抗MS液体培养基调OD值到0.5；步骤（3）侵染：将步骤(1)中得到的无菌苗打孔，以50-100个/管的比例与步骤（2）制备的侵染农杆菌混合，10min后立即将叶盘从侵染液中取出移至无菌吸水纸上，吸干叶盘表面侵染液；步骤（4）共培养：超净工作台中将步骤（3）最终得到的叶盘转移至共培养培养基中，28℃黑暗培养72小时；步骤（5）选择和分化培养：超净工作台中将步骤（4）最终得到的叶盘移至选择培养基中培养，每隔7-10天更换一次培养基；更换3次后叶盘边缘出现明显膨大的愈伤组织，更换5次后愈伤组织生出2cm左右分化芽；步骤（6）生根培养：超净工作台中将步骤（5）最终得到的分化芽用手术刀沿基部切下移至生根培养基中培养，约4-10天生根，生根后10-15天可移栽至盆中进行土培。进一步地，步骤（1）和（2）中，MS培养基为：MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，PH=5.75。进一步地，步骤（2）中，所述农杆菌菌种是LBA4404。进一步地，步骤（3）中，打孔后，烟草外植体叶盘的大小是5mm×5mm，侵染时间是10min。进一步地，步骤（4）中，共培养培养基为：MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，萘乙酸（NAA）0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤（6-BA）2.0mg/L，PH=5.75。进一步地，步骤（5）中，共培养培养基为：培养基为：MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，萘乙酸（NAA）0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤（6-BA）2.0mg/L，羧苄青霉素250mg/L，卡那霉素50mg/L，PH=5.75。进一步地，步骤（5）和（6）中，培养条件为：28℃光照16小时/25℃黑暗8小时。进一步地，步骤（6）中，培养基具体为：MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，羧苄青霉素250mg/L，卡那霉素100mg/L，PH=5.75。如现有技术相比，本专利技术有以下有益效果：1、培养基成分简单，方便易配。2、简化操作流程，大幅节省人力，具体在于：（1）侵染农杆菌直接由固体培养基获得，省掉需要隔夜培养的液体培养环节。（2）无菌苗叶片可直接侵染，省掉外植体48小时预培养环节，避免了大量培养基配制，减少反复外植体转移，降低机械损失，提高叶盘存活能力。（3）在侵染农杆菌菌液OD值等于0.5的条件下选择培养基直接抑菌，避免了共培养后繁杂的无菌水清洗。3、本专利技术的外植体转移次数减少，机械损伤降低，转化效率得到提升。4、本专利技术整个转化周期较传统方案缩短7-10天，生产率提升。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1本实施例的烟草品种红花大金元的高通量遗传转化方法，包括如下步骤：步骤（1）烟草品种红花大金元的无菌苗培育：取饱满的烟草种子，在超净工作台中经75％酒精处理浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用10％的次氯酸钠消毒10min，无菌水清洗5次，高压灭菌的滤纸吸干种子表面水分后接种到MS1培养基中，25℃下，培养35天左右获得无菌苗植株，如图1所示。MS1培养基具体组成为：MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，PH=5.75。步骤（2）侵染农杆菌制备：从-80℃冰箱取出预先冻存的含有pbi121质粒的LBA4404工程农杆菌，融化后吸取50μLpbi121工程农杆菌均匀涂布到包含50mg/L利福平，50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB抗性培养基中，28℃培养48小时后从培养箱中取出移至超净工作台，MS2液体培养基反复冲洗后将菌体用移液器转移至无菌50mL离心管中，摇匀，调OD值到0.5，即得到侵染农杆菌。MS2培养基具体组成为：MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，PH=5.75。步骤（3）侵染：将步骤（1）中得到的无菌苗植株，在超净工作台中用打孔器打孔获得5mm×5mm大小的烟草叶盘，取50个与步骤（2）制备的侵染农杆菌混合，10min后立即将叶盘从侵染液中取出移至无菌吸水纸上，吸干叶盘表面侵染液。步骤（4）共培养：超净工作台中，将步骤（3）最终得到的叶盘转移至MS3培养基中，28℃黑暗培养72小时，得到的叶盘如图2所示。MS3培养基具体组成为：MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L，萘乙酸（NAA）0.5mg/L，6-苄氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草高通量遗传转化的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）烟草无菌苗培育：取饱满的烟草种子，在超净工作台中分别经酒精和次氯酸钠消毒后接种到无抗MS培养基中，20‑25℃下培养30‑40天获得无菌苗植株；步骤（2）侵染农杆菌制备：取出预先冻存的农杆菌，融化后吸取50‑200ul均匀涂布到包含相应抗生素的YEB固体抗性培养基中，28℃下培养48‑72小时后从培养箱中取出移至超净工作台，用移液器吸取无抗MS液体培养基反复吹打菌体，将培养基与菌体的混合液转移至离心管中，摇匀，取无抗MS液体培养基调OD值到0.5；步骤（3）侵染：将步骤(1)中得到的无菌苗打孔，以50‑100个/管的比例与步骤（2）制备的侵染农杆菌混合，10min后立即将叶盘从侵染液中取出移至无菌吸水纸上，吸干叶盘表面侵染液；步骤（4）共培养：超净工作台中将步骤（3）最终得到的叶盘转移至共培养培养基中，28℃黑暗培养72小时；步骤（5）选择和分化培养：超净工作台中将步骤（4）最终得到的叶盘移至选择培养基中培养，每隔7‑10天更换一次培养基；更换3次后叶盘边缘出现明显膨大的愈伤组织，更换5次后愈伤组织生出2cm左右分化芽；步骤（6）生根培养：超净工作台中将步骤（5）最终得到的分化芽用手术刀沿基部切下移至生根培养基中培养，约4‑10天生根，生根后10‑15天可移栽至盆中进行土培。...

【技术特征摘要】
1.一种烟草高通量遗传转化的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）烟草无菌苗培育：取饱满的烟草种子，在超净工作台中分别经酒精和次氯酸钠消毒后接种到无抗MS培养基中，20-25℃下培养30-40天获得无菌苗植株；步骤（2）侵染农杆菌制备：取出预先冻存的农杆菌，融化后吸取50-200ul均匀涂布到包含相应抗生素的YEB固体抗性培养基中，28℃下培养48-72小时后从培养箱中取出移至超净工作台，用移液器吸取无抗MS液体培养基反复吹打菌体，将培养基与菌体的混合液转移至离心管中，摇匀，取无抗MS液体培养基调OD值到0.5；步骤（3）侵染：将步骤(1)中得到的无菌苗打孔，以50-100个/管的比例与步骤（2）制备的侵染农杆菌混合，10min后立即将叶盘从侵染液中取出移至无菌吸水纸上，吸干叶盘表面侵染液；步骤（4）共培养：超净工作台中将步骤（3）最终得到的叶盘转移至共培养培养基中，28℃黑暗培养72小时；步骤（5）选择和分化培养：超净工作台中将步骤（4）最终得到的叶盘移至选择培养基中培养，每隔7-10天更换一次培养基；更换3次后叶盘边缘出现明显膨大的愈伤组织，更换5次后愈伤组织生出2cm左右分化芽；步骤（6）生根培养：超净工作台中将步骤（5）最终得到的分化芽用手术刀沿基部切下移至生根培养基中培养，约4-10天生根，生根后10-15天可移栽至盆中进行土培。2.根据权利要求1所述的烟草高通量遗传转化的方法，其特征在于：步骤（1）和（2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建铎，李雪梅，陈章玉，杨光宇，向海英，曾婉俐，张涛，高茜，宋春满，许力，蒋佳芮，邓乐乐，杨文武，贾凌，夏庆友，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53