干细胞体外扩增培养体系及其方法技术

一种干细胞的体外扩增方法，采用含有烟酰胺类物质的扩增培养体系，以无血清培养基为基础培养基，添加了8％～12％胎牛血清、细胞因子组合物和烟酰胺类物质。所述细胞因子组合物包括干细胞因子、促血小板生成素、FLt3配体、G‑CSF、IL‑3和IL‑6。与常规培养体系相比，用本发明专利技术的培养体系培养CD34+细胞1周～12周，可以有效增加造血干细胞数量，提高CD34+/Lin‑和CD34+/CD38‑细胞比例，有助于解决造血干细胞移植中细胞数量不足的问题。

In Vitro Expansion and Culture System of Stem Cells and Its Methods

A method for in vitro amplification of stem cells was developed by using an amplification culture system containing nicotinamides and serum-free medium with 8%-12% fetal bovine serum, cytokine compositions and nicotinamides added. The cytokine composition comprises stem cell factor, thrombopoietin, FLt3 ligand, G_CSF, IL_3 and IL_6. Compared with the conventional culture system, the culture system of the present invention can effectively increase the number of hematopoietic stem cells, increase the proportion of CD34+/Lin_and CD34+/CD38 cells, and help to solve the problem of insufficient number of cells in hematopoietic stem cell transplantation.

【技术实现步骤摘要】
干细胞体外扩增培养体系及其方法
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种用于体外扩增干细胞的组合物，尤其是一种用于体外扩增造血干细胞的培养体系，以及造血干细胞的体外快速扩增培养方法。
技术介绍
造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSCs)是存在于造血组织和血液中的一类成体干细胞，具有自我更新能力和分化为所有成熟血细胞的潜能。HSCs是最早被人们发现和研究的干细胞，它在人胚胎发育第二周时出现于卵黄囊，大约在第四周时转移至胚胎肝，在妊娠五个月时进入骨髓进行造血。临床发现，大部分恶性血液疾病，如急性髓系白血病、慢性髓性白血病的发生和进展，都直接或间接地与HSCs异常有关。自从20世纪60年代发展至今，HSCs移植已经成为治疗各型白血病、再生障碍性贫血、β-地中海贫血等严重血液病和免疫系统疾病的重要医疗手段，同时也被应用于某些实体瘤的治疗，如淋巴瘤、小细胞肺癌等。目前临床应用的HSCs有三大来源，即骨髓、外周血和脐带血。造血干细胞数量不足是全球范围内限制其临床应用的主要障碍之一。骨髓或外周血HSCs移植对供、受者间配型要求极高，患者常常需要等待较长时间才能找到合适的供体，当单次采集所得的干细胞数量不足，则需要进行多次采集，对供者造成较大伤害；对于脐带血HSCs移植，单份脐带血中干细胞数量有限，这会导致一部分成人患者找不到符合临床移植条件的单份脐带血。因此，一种安全、有效的造血干细胞体外扩增方法亟需被建立。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种干细胞的体外培养体系，实现干细胞，尤其是造血干细胞数量的体外扩增。本专利技术的另一个目的在于提供一种干细胞的体外培养体系，抑制CD38的表达和/或活性。本专利技术的又一个目的在于提供一种干细胞的体外培养方法，增加可供临床移植应用的造血干细胞资源，如：用于移植治疗血液疾病、免疫系统疾病等。本专利技术的再一个目的在于提供一种干细胞的体外培养方法，以提供或增加造血干细胞资源用于科学研究，如：造血遗传调控机制研究、造血干细胞诱导分化研究、获得性免疫疗法开发等。CD38是一类细胞膜结合酶，其底物为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide，NAD)，其代谢产物为环腺苷二磷酸核糖(cyclicadenosinediphosphateribose，cADPR)和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NAADP)。研究表明，CD38具有信号传导功能，能够抑制造血祖细胞的生长，促进向人B淋巴细胞的分化与成熟。烟酰胺(化学式为C6H6N2O)是一种常见的CD38抑制剂，既可以直接抑制CD38的活性，也可以间接抑制CD38信号通路各组分的表达和/或活性(如：cADPR通路、钙释放通路或其他可影响CD38活性的信号通路)。本专利技术通过添加外源烟酰胺，干扰造血干细胞CD38的表达和/或活性，抑制其细胞分化进程，延长细胞增殖周期，从而实现造血干细胞的体外扩增的目的。本专利技术提供的一种干细胞体外扩增培养方法，所用培养体系中除了含有造血干细胞增殖所必需的营养物质之外，特别地，还添加烟酰胺类物质、早期效应细胞因子(earlyactingcytokines)和晚期效应细胞因子(lateactingcytokines)。其中，烟酰胺类物质包括但不限于烟酰胺、烟酰胺类似物(如：取代苯甲酰胺、取代烟酰胺、N-取代烟酰胺、烟碱硫代酰胺等)、烟酰胺及其类似物的衍生物(如：取代苯甲酰胺、取代烟酰胺、N-取代烟酰胺、烟碱硫代酰胺等)、烟酰胺及其类似物的代谢产物(如：NAD、NADH和NADPH等)等，这些物质单独或组合应用于本专利技术。早期效应细胞因子包括：但不限于肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)、FMS样的酪氨酸激酶3配体(FLT3ligand，Flt3L)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、白介素-3(interleukin-3，IL-3)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-12(interleukin-12，IL-12)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)和促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)等，这些细胞因子单独或组合应用于本专利技术。晚期效应细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolonystimulatingfactor，M-CSF)、红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、纤维母细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)和和HGF等，这些细胞因子也单独或组合应用于本专利技术。作为优选，烟酰胺类物质选择烟酰胺、苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酮酸中的一种或几种应用于本专利技术。具体地，烟酰胺类物质在扩增培养体系中的终浓度为0.1mM～20mM的，优先选择1mM～10mM，更优地选择1.0mM～6.0mM。作为优选，早期效应细胞因子选择HGF、TPO、Flt3L、IL-6和IL-3中的一种或几种。具体地，HGF的终浓度为30ng/mL～300ng/mL，TPO的终浓度为2ng/mL～20ng/mL，Flt3L配体的终浓度为50ng/mL～300ng/mL，IL-6的终浓度为10ng/mL～100ng/mL，以及IL-3的终浓度为20ng/mL～200ng/mL。作为优选，所述晚期效应细胞因子选择G-CSF、EPO中的一种或两种。具体地，G-CSF的终浓度为20ng/mL～80ng/mL，EPO的终浓度为2ng/mL～20ng/mL。本专利技术提供干细胞体外扩增培养方法，其培养时长为种子细胞接种后继续培养1周～12周，使干细胞的数量得到扩增同时不因培养时间过长而发生形态异常变化。本专利技术的扩增培养体系涉及的试剂、细胞因子、烟酰胺类物质均可通过商业化途径购买获得。本专利技术另一种干细胞体外扩增方法的实施方式为：首先，制备并获取造血干细胞；接着，富集CD34+细胞(如：用免疫磁珠分选法(DirectCD34ProgenitorCellIsolationKit，MiltenyiBiotec公司，德国))，使CD34+细胞的纯度高于20％；然后，在培养体系中悬浮培养富集得到的CD34+细胞，培养条件为：以细胞密度1×104/mL～5×104/mL接种于细胞培养板中(corningcostar公司，美国)，置于37℃、5％CO2的无菌培养箱中培养，约每3天～7天为细胞全量换液，当细胞扩增至一定数量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞体外扩增培养方法，其特征在于，培养过程中使干细胞与能抑制CD38表达和/或活性及CD38相关信号通路的表达和/或活性的物质相接触，延长细胞增殖周期，扩增CD34+细胞数量。

【技术特征摘要】
1.一种干细胞体外扩增培养方法，其特征在于，培养过程中使干细胞与能抑制CD38表达和/或活性及CD38相关信号通路的表达和/或活性的物质相接触，延长细胞增殖周期，扩增CD34+细胞数量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能抑制CD38表达和/或活性及CD38相关信号通路的表达和/或活性的物质为烟酰胺类物质。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺类物质是指能发挥类似烟酰胺作用的物质，选自于烟酰胺、烟酰胺类似物、烟酰胺及其类似物的衍生物、烟酰胺及其类似物的代谢产物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述烟酰胺类似物选自于苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酸之一种或几种；所述烟酰胺及其类似物的衍生物选自于取代苯甲酰胺、取代烟酰胺、N-取代烟酰胺、烟碱硫代酰胺之一种或几种；所述烟酰胺及其类似物的代谢产物为NAD、NADH和NADPH之一种或几种。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺类物质选自于烟酰胺、选自于苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸或α-氨基-3-吲哚丙酮酸之一种或几种。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为0.1mM～20mM。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mM～10mM。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mM～6.0mM。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以无血清培养基为基础培养基，还添加了8v/v％～12v/v％胎牛血清。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养体系中还外源性添加多种细胞因子，包括：早期效应细胞因子，其选自于肝细胞生长因子、FMS样的酪氨酸激酶3配体、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α和促血小板生成素之一种或几种；和晚期效应细胞因子，其选自于粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、白血病抑制因子和肝细胞因子。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述外源添加的多种细胞因子为SCF30ng/mL～300ng/mL、TPO2ng/mL～20ng/mL、FLt3配体50ng/mL～300ng/mL、IL-610ng/mL～100ng/mL和IL-320ng/mL～200ng/mL。12.根据权利要求10所述的体外扩增干细胞的培养体系，其特征在于，还添加G-CSF20ng/mL～80ng/mL，EPO2ng/mL～20ng/mL。13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞可来自于健康供体的新鲜的...

【专利技术属性】
技术研发人员：章毅，伍婷，陈侃俊，李冉，陈亮，陆薇，
申请(专利权)人：章毅，中国干细胞集团上海生物科技有限公司，重庆市干细胞技术有限公司，中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司，上海市干细胞技术有限公司，陕西省干细胞技术有限公司，苏州市干细胞技术有限公司，三亚市干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31