一种目标DNA富集的方法和应用技术

本申请公开了一种目标DNA富集的方法和应用。本申请的目标DNA富集方法包括，蛋白核酸复合物制备步骤，将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成蛋白核酸复合物；同源性重组步骤，采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与蛋白核酸复合物反应；生物素标记分离步骤，包括利用双链DNA探针中的生物素标记，将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集。本申请的富集方法，采用双链DNA探针和同源重组酶能靶向富集待测样本中的单链目标DNA；并且效率高、均匀性和稳定性好，特别适合于多靶标DNA或者拷贝数较低的目标DNA的富集。本申请富集方法采用的双链DNA探针制备方法简单、易操作，且成本低。

A Target DNA Enrichment Method and Its Application

This application discloses a method and application of target DNA enrichment. The target DNA enrichment method in this application includes: preparation steps of protein nucleic acid complexes, assembly of homologous recombinase and single stranded DNA of the sample to be tested into protein nucleic acid complexes; homologous recombination steps, reaction of double stranded DNA probes with biotin labeling and homologous to target DNA with protein nucleic acid complexes; and biotin labeling separation steps, including using double stranded DNA probes in double stranded DNA probes. Biotin markers are used to isolate and enrich homologous single-stranded target DNA. The proposed enrichment method uses double-stranded DNA probes and homologous recombinant enzymes to target single-stranded target DNA in the samples to be tested, and has high efficiency, uniformity and stability, especially suitable for multi-target DNA or target DNA with low copy number. The preparation method of double stranded DNA probe used in the application enrichment method is simple, easy to operate and low in cost.

【技术实现步骤摘要】
一种目标DNA富集的方法和应用
本申请涉及DNA富集领域，特别是涉及一种目标DNA富集的方法和应用。
技术介绍
新一代测序技术(NGS)和平台的快速发展和应用使得多区域同时测序成为可能。尽管全基因组测序成本正在不断下降，但选择感兴趣的目标基因或区域进行测序和分析仍然更加符合当前实际和成本效益。因此，目标DNA富集技术成为新一代测序技术前的最常用技术之一。目前常用的目标区域富集技术主要有如下几种：1)基于特异性引物扩增的方法；2)基于寡核苷酸探针杂交捕获的方法；3)基于反向探针杂交的方法。这三种常用方法都有其各自的优势和劣势。基于引物特异性扩增的方法一般比较直接方便，但是对于目标区域特别多的情况，需要采用多组引物对进行多重扩增，而多重扩增时往往会发生各个特异性引物之间错误扩增的情况，并且多重扩增难以保障每一对引物的扩增效率。基于寡核苷酸探针杂交捕获的方法能够检测大批量的目标区域。常应用在人全外显子的捕获测序中。该方法能够捕获并检测多种变异类型，如单核苷酸变异、小的插入和缺失，甚至拷贝数变异等等。但是该方法中杂交捕获的试剂和探针价格比较昂贵，并且杂交捕获的时间要长，一般都要16小时到48小时。基于反向探针杂交的方法是指设计一段两端含有目标区域两侧序列互补序列的寡核苷酸探针。与目标分子杂交并延伸连接后形成单链环状。再通过探针上的通用序列设计引物进行扩增。该方法具有特异性引物扩增和寡核苷酸杂交捕获的部分优势，探针设计复杂，杂交效率和分子利用率并不高。因此，为了满足日益广泛的基因测序需求，研发一种更有效的目标DNA富集试剂或方法，是本领域的研究重点。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的目标DNA富集的方法和应用。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种目标DNA富集的方法，包括以下步骤，蛋白核酸复合物制备步骤，包括将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物；同源性重组步骤，包括采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与蛋白核酸复合物反应，在同源重组酶的作用下，双链DNA探针与单链的目标DNA结合；生物素标记分离步骤，包括利用双链DNA探针中的生物素标记，将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集。其中，同源重组酶与单链DNA组装成蛋白核酸复合物，可以参考常规的同源重组酶与单链DNA结合时采用的组装试剂和方法，在此不作具体限定。需要说明的是，本申请的目标DNA富集方法，创造性的利用同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物；然后利用事先设计好的与目标DNA同源性的双链DNA探针，即双链DNA片段，与蛋白核酸复合物同源性结合，并利用双链DNA探针上带有的生物素标记，将待测样本的单链目标DNA分离出来，实现目标DNA富集。本申请的富集方法，一方面，利用同源重组酶的促进识别效果，能够有效的对目标DNA进行结合、分离；另一方面，本申请富集方法采用的双链DNA探针制备方法简单，相对于传统的单链探针而言，本申请的一种实现方式中只需要进行常规的PCR扩增或者对PCR扩增产物进行打断处理，即可获得双链DNA探针，制备简单、方便，降低了目标DNA富集的探针成本。优选的，本申请的目标DNA富集方法还包括解组装步骤，解组装步骤包括，在生物素标记分离步骤之后，采用解组装试剂，使富集的单链目标DNA从蛋白核酸复合物中解离出来。需要说明的是，蛋白核酸复合物的作用是，利用同源重组酶的促进识别和同源性结合作用，使得与双链DNA探针具有同源性的单链目标DNA能够准确、有效的与双链DNA探针结合，进而方便将单链目标DNA分离出来，实现富集；可以理解，如果需要获得单独的单链目标DNA产品，则需要采用常规的解组装方法，将单链目标DNA从蛋白核酸复合物中解离出来；当然，如果仅仅是将单链目标DNA分离富集，或者有其它用途，也可以不需要解组装步骤。优选的，本申请的目标DNA富集方法还包括对待测样本的核酸进行变性处理，获得单链DNA。优选的，在进行变性处理之前或之后对待测样本进行打断处理。需要说明的是，一般来说，提取的DNA样品都是双链结构，并且片段都比较长；而本申请的目标DNA富集方法，需要使用短片段的单链DNA，因此，本申请的目标DNA富集方法还可以进一步的包括变性，将双链变性为单链，或者将待测样本打断处理成短片段。当然，对于本申请就是短片段DNA的样本，则不需要打断处理。优选的，生物素标记分离步骤，具体采用亲和素修饰的磁珠进行。优选的，同源重组酶为RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR、Rad51和Mre11-Rad50中的至少一种。更优选的，同源重组酶为RecA或Rad51。优选的，双链DNA探针的长度为50bp-100bp。优选的，本申请的目标DNA富集方法中使用的双链DNA探针采用以下方法制备获得：采用扩增引物对待测样本的DNA进行PCR扩增，并且，在PCR扩增的过程中，采用的dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的至少一种带有生物素标记；PCR扩增产物即双链DNA探针；其中，扩增引物能够特异性的扩增待测样本的目标DNA的全部或部分序列。需要说明的是，本申请的双链DNA探针的长度为50bp-100bp，因此，对于大于100bp的PCR扩增产物，本申请进一步的还可以包括对PCR扩增产物进行打断处理。此外，为了获得纯的双链DNA探针，本申请进一步还可以包括对PCR扩增产物或打断处理的产物进行纯化，例如磁珠纯化或其它方式的纯化。本申请的另一面公开了本申请的目标DNA富集方法在目标DNA的测序或文库构建中的应用。本申请的再一面公开了一种目标DNA的文库构建方法，包括采用本申请的目标DNA富集方法对目标DNA进行富集，然后再进行后续的文库构建步骤。本申请的再一面公开了一种目标DNA的测序方法，包括采用本申请的文库构建方法制备测序文库，然后对制备的测序文库进行测序。可以理解，本申请的目标DNA富集方法，其核心的试剂，例如双链DNA探针和同源重组酶，完全可以单独作为一种用于目标DNA富集的试剂盒使用。因此，在提出本申请的目标DNA富集方法的同时，本申请还提供了一种用于目标DNA富集的试剂盒，包括双链DNA探针和同源重组酶；双链DNA探针中的腺嘌呤脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸中的至少一种上带有生物素标记；同源重组酶用于与待测样本的单链DNA结合，并促进双链DNA探针与待测样本中的同源性单链DNA结合；利用双链DNA探针中的生物素标记，将在同源重组酶作用下与双链DNA探针结合的同源性单链DNA分离、富集，起到目标DNA富集的效果。需要说明的是，本申请的关键在于利用同源重组酶对同源性核酸的识别和靶标作用，将与双链DNA探针同源性的待测样本目标DNA分离，从而起到目标DNA富集的效果。一般来说，同源重组酶是与单链DNA组合成核酸蛋白复合物，然后，在同源重组酶的作用下，将单链DNA结合到与之同源性的双链DNA上；但是，本申请创造性的，反向操作，将双链DNA作为探针，用双链DNA去靶向待测样本中的单链目标DNA；所以，本申请的试剂盒中包含有双链DNA探针和同源重组酶。本申请的试剂盒中，同源重组酶可以采用现有的常规使用的同源重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种目标DNA富集的方法，其特征在于：包括以下步骤，蛋白核酸复合物制备步骤，包括将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物；同源性重组步骤，包括采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与所述蛋白核酸复合物反应，在同源重组酶的作用下，双链DNA探针与单链的目标DNA结合；生物素标记分离步骤，包括利用所述双链DNA探针中的生物素标记，将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集。

【技术特征摘要】
1.一种目标DNA富集的方法，其特征在于：包括以下步骤，蛋白核酸复合物制备步骤，包括将同源重组酶与待测样本的单链DNA组装成稳定的蛋白核酸复合物；同源性重组步骤，包括采用带有生物素标记的与目标DNA具有同源性的双链DNA探针与所述蛋白核酸复合物反应，在同源重组酶的作用下，双链DNA探针与单链的目标DNA结合；生物素标记分离步骤，包括利用所述双链DNA探针中的生物素标记，将与之结合的同源性单链目标DNA分离、富集。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括解组装步骤，所述解组装步骤包括，在生物素标记分离步骤之后，采用解组装试剂，使富集的单链目标DNA从蛋白核酸复合物中解离出来。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：还包括对待测样本的核酸进行变性处理，获得单链DNA；优选的，在进行变性处理之前或之后对待测样本进行打断处理。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述生物素标记分离步骤，具体采用亲和素修饰的磁珠进行。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述同源重组酶为RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR、Rad51和Mre11-Rad5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永利，宋卓，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43