大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析，属于遗传工程技术领域，其特征在于通过对大豆植株进行荧光定量PCR对基因功能进行初步分析，利用对植株喷施细胞分裂素对大豆再生相关基因GmESRSWa进行克隆，利用农杆菌介导的方法对大豆进行遗传转化，通过过量表达来研究GmESRSWa基因的功能。同时，根据植株的表型分析和分子检测手段研究该基因与大豆再生之间关系，寻找到并克隆大豆再生相关基因GmESRSWa(Seq ID No:1)。
【技术实现步骤摘要】
大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析
本专利技术涉及一种大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析，属于遗传工程
技术介绍
大豆是我国重要的粮经作物之一，我国是世界上大豆的主要生产国之一(年均总产量1500万吨)，同时也是世界上最大的大豆消费国(年均消耗量近8000万吨)，国产大豆远不能满足国内消费需求，每年需进口大豆5500多万吨。大豆再生体系建立难和遗传转化效率低都严重制约着大豆育种的发展。生物学里的再生是指生物体对失去的结构重新自我修复和替代的过程。植物再生是一个无性繁殖的过程，即植物体对外源植物激素信号的应答，已分化的细胞进行脱分化，静止细胞的再分裂和进入特定组织或器官原基的再生发育路径。总的来说，植物先通过细胞进行脱分化获得了再生能力，随后通过外源激素的刺激来进行细胞增殖及根器官建成能力获得和芽器官发生能力形成，最后摆脱激素依赖进行组织器官再生过程。Haberlandt在1902首次提出了植物体细胞胚的定义，提出每一个植物细胞都能进行不间断的分裂，而后发育成完整植株，说明了植物细胞具有全能性，植物的再生途径广义上可以分为两种，第一种是利用体细胞胚进行发生途径；第二种是利用器官进行发生途径，形成不定根或者不定芽进而诱导芽和根的再生。体细胞在特殊的条件下不经性细胞融合而是经过合子胚相似发育途径，逐渐发育形成崭新个体的形态发生过程被称为植物体细胞胚胎发生。相似合子胚的结构在生物学中被称为胚状体。1958年的Steward和1959年的Reinert首次发现了体细胞胚的发生，随着时代的发展和分子生物学的进步，植物体细胞胚的发生机理逐渐被人们所了解，科学家已经从一百多种植物中分离出体细胞胚，虽然体细胞胚发生在自然界是普遍存在的，但是其分化却极为复杂。植物体细胞胚越来越受到重视，在种质资源的保存、突变体的诱导、基因和细胞工程等方面有很多应用价值。2001年HiroharuBanno等从拟南芥中利用cDNA文库的方法成功克隆得到ESR1基因，拟南芥ESR1基因是受细胞分裂素诱导密切相关的AP2基因家族的成员，这一类基因的共同特征是有一个AP2结构域，ESR1基因的AP2结构域与已知的EREBPs、AtEBP、AtERFs结构域十分相似，由于这些区域均能编码乙烯应答系统中的GCCbox所以这些转录区域被认为是乙烯信号途径中的一部分。大豆的遗传转化效率低、再生体系建立难已严重阻碍大豆分子育种和大豆基因功能的研究。自Hinchee等(1988)和McCabe等(1988)分别用农杆菌介导法和基因枪法转化获得转基因大豆植株以来，虽然又有很多报道但是突破性结果很少，由于大豆的遗传转化效率低下，越来越多的研究者开始把注意力转移到大豆高效再生体系的建立及大豆再生相关基因克隆上来，通过优化再生条件及分析再生相关基因功能进而解决大豆再生率低这一世界性难题。再生相关基因还能够以一种新型无争议的生物安全标记基因来替代抗生素、除草剂等选择标记，在导入外源目的基因的同时提高受体植物的再生能力，对植物转基因育种效率及转基因新品种的安全性具有重要意义(李文凤，等2010)。因此，如何通过现代分子生物学技术从根本上提高大豆的再生率，找到并克隆出控制大豆再生的基因，解决遗传转化效率低、再生体系建立难成为急需解决的一大难题。所以，通过对大豆植株进行荧光定量PCR对基因功能进行初步分析，利用对植株喷施细胞分裂素对大豆再生相关基因GmESRSWa进行克隆，利用农杆菌介导的方法对大豆进行遗传转化，通过过量表达来研究GmESRSWa基因的功能。同时，根据植株的表型分析和分子检测手段研究该基因与大豆再生之间关系，寻找到并克隆大豆再生相关基因GmESRSWa，专利技术一种大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析是必要的。
技术实现思路
为了克服大豆遗传转化效率低、再生体系建立难的难题，本专利技术提供了大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析，该专利技术通过对大豆植株进行荧光定量PCR对基因功能进行初步分析，利用对植株喷施细胞分裂素对大豆再生相关基因GmESRSWa进行克隆，利用农杆菌介导的方法对大豆进行遗传转化，通过过量表达来研究GmESRSWa基因的功能。同时，根据植株的表型分析和分子检测手段研究该基因与大豆再生之间关系，寻找到并克隆大豆再生相关基因GmESRSWa(SeqIDNo:1)。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术的一种大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析，其特征在于利用同源克隆技术通过对植株喷施细胞分裂素的方法，克隆得到细胞分裂素信号途径中的转录因子GmESRSWa基因(SeqIDNo:1)。具体步骤如下：(一)GmESRSWa基因表达模式的研究1.大豆的培养及6-BA处理：对大豆GmESRSWa基因的组织特异性表达进行分析，将品种为东农50的大豆种子种植于人工培养箱中，培养条件为长日照(16h光照/8h黑暗)、25℃。长出第二片三出复叶时，对植株叶、根、茎进行取材，待开花结荚后对未成熟胚、花、豆荚进行取材，均放入液氮中保存备用。采用实时荧光定量PCR的方法对GmESRSWa基因的组织特异性表达进行分析，结果表明GmESRSWa基因在大豆的茎、花和未成熟胚中表达量较高，可推测GmESRSWa基因在茎的伸长、花的形态建成以及胚再生中均发挥一定作用。对细胞分裂素(6-BA)对大豆GmESRSWa基因的表达影响进行分析，待大豆植株长出第二片三出复叶时，选取长势相同的植株，对照喷洒水，实验组喷洒100mg/L的6-BA。分别于外源细胞分裂素处理后的0，1，2，4，8，12，24h后取叶片，放入液氮中保存备用。采用实时荧光定量PCR的方法对GmESRSWa基因受细胞分裂素影响进行分析，结果表明GmESRSWa基因受细胞分裂素处理1小时内持续上升并且在1小时时表达量达到最高，在处理后4小时后表达量趋于平稳，可推测细胞分裂素对GmESRSWa基因的影响在1小时内完成的。2.植物RNA的提取：按照RNAisoPlus的方法提取大豆叶片总RNA3.RNA的反转录4.实时定量PCR(二)大豆GmESRSWa基因的克隆和序列分析1.CTAB法大量抽提大豆叶片基因组DNA。2.GmESRSWa基因引物设计：在Phytozome大豆基因组中调出GmESRSWa基因序列，应用Primer5.0软件对其设计引物及其酶切位点分析，在基因上游引物5′端添加BamHⅠ酶切位点，下游引物5′端添加SacⅠ酶切位点。3.利用PCR扩增GmESRSWa基因4.PCR产物的纯化和胶回收：将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，采用上海华舜生物工程有限公司的胶回收试剂盒回收DNA片段。5.PCR回收产物的连接：取3μL胶回收产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测定量，将回收的目的片断与pMD19-TVector连接。6.大肠杆菌的感受态的制备7.连接产物的转化8.目的片段的PCR鉴定：利用SDS小量法提取受细胞分裂素喷施的东农50总DNA。利用设计的特异性引物进行PCR反应，获得片段长度为894bp。9.GmESRSWa基因的全长序列获得和大豆中不同拷贝同源性分析：(1)利用NCBI的在线blast工具检测DNA序列的正确性。(2)利用DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析，其特征在于利用同源克隆技术通过对植株喷施细胞分裂素的方法，克隆得到细胞分裂素信号途径中的转录因子GmESRSWa基因(Seq ID No:1)，该基因全长894bp。
【技术特征摘要】
1.大豆再生相关基因(GmESRSWa)及其表达分析，其特征在于利用同源克隆技术通过对植株喷施细胞分裂素的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：武小霞，苏安玉，武晓云，陈庆山，程晓非，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23
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