一种棉花抗枯萎病基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种棉花抗枯萎病基因及其应用。从棉花群体抗枯萎病鉴定和全基因组关联分析将陆地棉抗枯萎病基因定位在17号染色体1.7‑2.1Mb的400kb的基因组区间内。利用病毒介导的基因沉默技术对这一基因组区间所有基因的表达进行抑制并接种鉴定后筛选得到棉花抗枯萎病主效基因GhFov1。该基因编码一种谷氨酸受体蛋白激酶，抗病的陆地棉中被沉默后极显著地降低了对枯萎病的抗性。转化烟草发现GhFov1蛋白可识别棉花枯萎病菌并激活免疫反应产生过敏性坏死。开发了一对能检测陆地棉中GhFov1基因型的引物，利用该引物和优化的PCR反应体系可对棉花种质资源和品种的枯萎病抗性进行评价。

A Fusarium Wilt Resistance Gene in Cotton and Its Application

The invention belongs to the field of plant genetic engineering technology, in particular to a cotton Fusarium Wilt Resistance Gene and its application. Fusarium wilt resistance genes of upland cotton were located in the 400 KB genome of chromosome 17 1.7 2.1 Mb based on the identification of Fusarium Wilt Resistance in Cotton Population and genome-wide association analysis. Virus-mediated gene silencing technique was used to inhibit the expression of all genes in this genome region. After inoculation and identification, the main gene GhFov1 for Cotton Fusarium wilt resistance was screened. The gene encodes a glutamate receptor protein kinase, which significantly reduces resistance to Fusarium Wilt in disease-resistant upland cotton after being silenced. The transformed tobacco showed that GhFov1 protein could recognize Fusarium oxysporum and activate immune response to produce anaphylactic necrosis. A pair of primers were developed to detect GhFov1 genotype in Upland cotton. The primers and optimized PCR reaction system could be used to evaluate the resistance of cotton germplasm resources and varieties to Fusarium wilt.

【技术实现步骤摘要】
一种棉花抗枯萎病基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及棉花枯萎病抗病基因的鉴定和一种棉花抗枯萎病分子标记的开发与应用。
技术介绍
枯萎病是棉花生产中一种世界性的土传病害，发病严重时可导致处于苗期和蕾铃期棉株枯死从而造成棉花绝产，发病较轻时也会导致棉株发育迟缓，结铃少，吐絮不畅从而导致纤维品质和产量下降(万英；2005)。枯萎病的发生给棉花的生产带来了不可估量的损失，严重影响了棉花生产的稳定性和可持续性发展。在我国最大的棉花产区新疆，棉花枯萎病仍时有发生。防治棉花枯萎病最有效的方法是选育和推广抗病品种。从上世纪50年代开始，育种工作者开展了陆地棉抗枯萎病的育种工作，筛选到抗枯萎病的种质资源并获得了广泛应用(吕学莲；2008)。虽然从遗传学上证明陆地棉抗枯萎病基因为主效抗病基因，但目前还未有陆地棉抗枯萎病基因被鉴定和克隆的报道，陆地棉抗枯萎病的分子机制也不清楚。近年有少数关于棉花抗枯萎病基因的定位研究。2009年Wang等开展了棉花抗枯萎病菌7号生理小种的QTL定位。该研究以高抗枯萎病的陆地棉栽培种‘中棉所35’和感病陆地棉栽培种‘军棉一号’为亲本，构建了F2:3分离群体；运用SSR标记构建连锁图谱，用复合区间作图法对F2:3家系的病情指数进行基因组QTL扫描，一共检测到了4个与棉花枯萎病相关的QTL位点，分别位于A07、D01、D03、D09染色体上(Wangetal；2009)。因此目前人们依然采用传统的枯萎病病圃筛选以评价棉花对枯萎病的抗性。克隆鉴定棉花抗枯萎病基因有助于我们了解棉花抗枯萎病的分子机制，同时为棉花抗枯萎病分子育种提供可靠分子标记。谷氨酸是动物中枢神经系统中一种重要的兴奋性神经递质，可与其特定的受体谷氨酸受体蛋白特异性的结合(OrregoandVillanueva1993)。谷氨酸受体蛋白根据其作用的不同可划分为两种不同的类型：一种是借由G蛋白偶联受体激活第二信使的代谢型受体mGLR；一种是调控离子通道促进离子内流的离子型受体iGLR(Ozawaetal1998；RodríguezandLópez1997)。1998年Lam等首次在拟南芥中鉴定到了20个谷氨酸受体蛋白基因，并与动物中离子型受体较为同源。同动物中离子型谷氨酸受体一样，拟南芥中的谷氨酸受体也含有6个功能结构域，包括4个跨膜结构域(M1-M4)和2个配体结合域(S1和S2)(Lametal；1998)。进化分析表明，植物GLRs与动物的iGLRs有着共同的起源，由原始的谷氨酸受体蛋白进化形成，而原始的谷氨酸受体蛋白则由细菌周质结合蛋白进化形成(Chiuetal；1999)。此外原始的谷氨酸受体蛋白进化形成了原始G蛋白偶联受体亚家族C，其后原始G蛋白偶联受体亚家族C进一步进化为动物的代谢型谷氨酸受体蛋白和γ氨基丁酸受体蛋白(Turanoetal；2001)。γ氨基丁酸受体蛋白可特异性地结合γ氨基丁酸，γ氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸产生。deSain等通过Pull-down实验证实番茄枯萎病的无毒蛋白SIX4可与谷氨酸脱羧酶互作(deSainandRep2015)，这也反映了谷氨酸受体蛋白可能参与了番茄对枯萎病抗性的调节过程。基于动物中离子型谷氨酸受体蛋白的作用机理，研究者推测植物中谷氨酸受体蛋白存在与动物中类似的机制，即存在激活与脱敏的过程。激活状态的GLR会识别并且结合配体，从而激活Ca2+等阳离子实现跨膜转运流向细胞内。此后GLR会处于脱敏状态，不再产生Ca2+内流以防止Ca2+持续性的转运。此时GLR依然保持着与配体结合的状态，使命完成后配体会被释放出来或者被转运到细胞内降解(Meyerhoffetal2005；Stephensetal2008)。不过与动物中不同的是，在动物中谷氨酸受体仅特异性的结合谷氨酸，其配体具有很强的特异性；而植物的谷氨酸受体则具有更加广泛的配体。目前已发现20种蛋白质氨基酸中的12种氨基酸和谷胱甘肽均可作为谷氨酸受体的配体(Qietal；2006；Stephensetal；2008；Tapkenetal；2013；Vincilletal；2012)。随着植物中谷氨酸受体蛋白的发现，越来越多的研究证实谷氨酸受体蛋白在植物防御反应中扮演着重要的角色。Kang等发现当将小萝卜中的RsGLR外源导入到拟南芥中，可以激活与防御相关的基因的表达并且增强了对死体营养性病原菌灰霉的抗性(Kangetal；2006)。通过对拟南芥glr突变体的研究，发现atglr3.3对丁香假单孢杆菌的感病性增强，受丁香假单孢杆菌诱导表达的与防御相关标记基因的表达极大削弱，且在突变体中当外源添加GSH时钙离子向胞内的流入受到抑制(Lietal；2013)。此外，在突变体中寡聚半乳糖醛酸所诱导的活性氧和一氧化氮的积累减弱，寡聚半乳糖醛酸所诱导的防御相关基因的表达也受到抑制，对活体营养性病原菌白粉病的抗性减弱，不过该突变体对死体营养型病原菌灰霉的抗性不受影响(Manzooretal；2013)。同时Mousavi等发现AtGLR还参与了伤诱导后茉莉酸信号在远距离的传递，其可以促进植物受伤刺激后JAZ的表达(Mousavietal；2013)。根据以上这些关于GLR在植物防御反应中的研究，Forde等推断了GLR在植物防御反应中可能的一个作用模型，认为GLR的配体可能作为一种DAMP(damage-asscociatedmolecularpattern)。当植物受到病原菌侵染时，植物自我损伤的细胞会释放出一些小分子物质，其中释放出的氨基酸可以被位于膜上的GLR识别进而激活Ca2+内流，Ca2+作为第二信使将信号传递下去从而激活依赖于JA或者SA的防御反应(FordeandRoberts2014)。在本专利技术提出之前，并未见到关于陆地棉抗枯萎病主效基因的克隆和鉴定的报道，在本专利技术中，申请人利用棉花自然群体进行抗病鉴定并通过全基因组关联分析，将棉花抗枯萎病遗传位点定位在D03染色体上1.7-2.1Mb这一大约400Kb的区域。该基因组区域内共有24个候选基因，利用VIGS抑制候选基因表达并进行接种枯萎病菌处理以检测候选基因对棉花抗枯萎病的作用。最终申请人鉴定到棉花主效抗枯萎病基因GhFov1。抑制该基因的表达后使得棉花对枯萎病的抗性完全丧失。目前植物中已鉴定到的抗病主效基因主要分为三大类：RLP、RLK和NBS-LRR类。GhFov1基因编码一种谷氨酸受体蛋白，为一种新类型的抗病基因。根据抗枯萎病和感枯萎病陆地棉品种中该等位基因序列差异，申请人利用SNP差异设计了一对能检测抗病基因型和感病基因型的引物对。利用该引物对和优化的PCR反应体系能特异地只在具有抗病基因型棉花品种中扩增获得特异性的分子标记。这为棉花品种抗枯萎病检测提供了一种简单便捷的鉴定方法，本专利技术的分子标记可应用于棉花抗枯萎病分子标记辅助选择育种上。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一个棉花主效抗枯萎病基因GhFov1。通过棉花自然群体的全基因组关联分析确定了棉花抗枯萎病基因位点，利用VIGS抑制候选基因表达并接种枯萎病菌快速鉴定候选基因的功能，并最终鉴定到棉花主效抗枯萎病基因GhFov1。该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，或至少50本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种棉花抗枯萎病基因GhFov1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种棉花抗枯萎病基因GhFov1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种棉花抗枯萎病基因GhFov1，该基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO：2所示。3.如权利要求1所述的一种棉花抗枯萎病基因GhFov1在棉花抗枯萎病中的应用。4.如权利要求2所述的一种棉花抗枯萎病基因GhFov1编码序列在调控棉花枯萎病抗性中的应用。5.一种检测棉花抗枯萎病基因的分子标记引物，其特征在于，该基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱龙付，张献龙，柳仕明，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42