一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用，烟碱合成调控基因NtERF115核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明专利技术还公开了烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtERF115基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtERF115基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控NtERF115基因的表达，可提高烟草烟叶中烟碱含量。

Cloning and application of a nicotine synthesis regulatory gene NtERF115 in tobacco

The invention discloses a nicotine synthesis regulatory gene NtERF115 and its cloning method and application. The nucleotide sequence of the nicotine synthesis regulatory gene NtERF115 is shown in SEQ ID:No.1 and the encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID:No.2. The invention also discloses the cloning method of the nicotine synthesis regulatory gene NtERF115, which includes: A, determining the sequence of NtERF115 gene; B, extracting tobacco RNA and retranscribing to obtain the first chain of cDNA; C, designing and synthesizing specific primers according to the sequence of NtERF115 gene, using the DNA as template for PCR amplification; D, recovering and purifying the PCR products; E, connecting the purified products with vectors, and transforming them. Sensitive cells; F, screening positive clones, PCR amplification and sequencing of positive clones. By regulating the expression of NtERF115 gene, nicotine content in tobacco leaves could be increased.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法与应用。
技术介绍
烟草（Nicotianatabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟碱是栽培烟草重要的特征化合物，占烟草总生物碱的95%左右。ERF(EthyleneResponsiveFactor)转录因子基因是调控烟碱合成重要的调控因子。烟草中调控烟碱合成的NIC2遗传位点已被发现是由至少7个ERF基因组成，如ERF189等。ERF类转录因子基因调控烟碱合成的分子机理也逐渐清晰，可以通过直接结合烟碱合成途径基因启动子中的GCC-box来激活该基因的表达，进而增强烟碱的合成。我们通过对茉莉素处理后烟草BY-2细胞系的转录组进行分析后获得NtERF115基因，并进行了理论研究和应用实践，发现过表达NtERF115能够显著提高烟草烟叶中烟碱含量，为利用植物基因工程技术提高烟叶中烟碱含量提供了靶标基因。国际上一些知名烟草公司和研究机构正研究利用生物技术手段提高烟草烟碱含量，以提高烟草品质，降低电子烟等产品的烟碱原料生产成本。目前，我国也深入研究烟碱合成的调控机理，为培育高烟碱低焦油烟草品种提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115；第二目的在于提供所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、确定NtERF115基因序列；通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列设计基因克隆引物：正向引物：5’-CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；反向引物：5’-ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC-3’；B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，利用NtERF115基因克隆引物进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟，回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行培养，取2mL菌液提取质粒，进行质粒PCR检测，对阳性克隆进行测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115在获得烟碱含量显著提高的转基因植株中的应用；即所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115用于提高烟草烟叶的烟碱含量。本专利技术从烟草中得到一个烟草烟碱合成调控基因NtERF115，具体步骤为：通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列信息设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtERF115基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtERF115基因的过表达（OE）株系，对NtERF115进行功能鉴定，结果表明NtERF115基因具有提高烟草烟碱含量的功能。NtERF115基因的发现，为调控烟草烟碱的合成提供了基因资源。附图说明图1为NtERF115基因的克隆；图2为菌落PCR检测重组过表达载体Pk2-ERF115的农杆菌转化效果；图3为T1代过表达株系目标基因表达水平分析；图4为T1代转基因株系烟叶烟碱含量分析。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：A、确定NtERF115基因序列；通过分析茉莉素处理后BY-2细胞的转录组数据，获得受茉莉素正向调控ERF家族基因1个，序列比对发现该基因为NtERF115。根据该基因序列设计基因克隆引物：正向引物：5’-CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；反向引物：5’-ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC-3’；B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，利用NtERF115基因克隆引物进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟，回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行培养，取2mL菌液提取质粒，进行质粒PCR检测，对阳性克隆进行测序。C步骤中所述的特异性引物（正反向引物）为：正向引物：5’-CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；反向引物：5’-ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC-3’；D步骤中所述的培养基为：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g溶解于1L蒸馏水中，高温灭菌（121℃，25min）后使用。本专利技术所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用为所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115在用于获得烟叶烟碱含量显著提高的转基因植株中的应用。所述获得烟叶烟碱含量显本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草烟碱合成调控基因NtERF115，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种权利要求1或2所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：A、确定NtERF115基因序列；根据烟草BY-2细胞转录组分析获得NtERF115基因序列，利用此序列设计基因克隆引物：正向引物：5’-CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；反向引物：5’-ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC-3’；B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtERF115基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL；PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟，回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5α，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养、质粒提取和PCR检测，对阳性克隆进行测序。4.根据权利要求3所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于C步骤中所述的特异性引物为：正向引物：5’-CGGGATCCATGAATCCCAATAATGCAACCT-3’；反向引物：5’-ATGCGGCCGCTTATAGCAGCATTTGTAGGTTC-3’；根据权利要求3所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的克隆方法，其特征在于D步骤中所述的培养基为：称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g溶解于1L蒸馏水中，高温灭菌（121℃，25min）后使用。5.一种权利要求1所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用，其特征在于所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115在获得烟碱含量显著提高的转基因植株中的应用。6.根据权利要求6所述的烟草烟碱合成调控基因NtERF115的应用，其特征在于所述获得NtERF115转基因烟草的方法包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丙武，宋中邦，高玉龙，李文正，李梅云，隋学艺，赵璐，韩生成，师君丽，孔光辉，曾建敏，邹聪明，刘勇，黄昌军，吴兴富，徐向丽，贺晓辉，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53