用于致病性大肠埃希氏菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了用于致病性大肠埃希氏菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒，具体地，本发明专利技术公开了能够用于致病性大肠埃希氏菌检测的引物对和探针，对目标菌株的DNA进行实时荧光PCR检测时，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。

Polynucleotides, methods and kits for detection of pathogenic Escherichia coli

The invention provides polynucleotides, methods and kits for detection of pathogenic Escherichia coli. Specifically, the invention discloses primer pairs and probes for detection of pathogenic Escherichia coli, which have excellent specificity and sensitivity and good stability in real-time fluorescence PCR detection of target strain DNA.

【技术实现步骤摘要】
用于致病性大肠埃希氏菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及用于致病性大肠埃希氏菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。
技术介绍
大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，被认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜，常引起严重腹泻和败血症，根据不同的生物学特性将可致病的大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。目前，在大肠杆菌检测中常用的检测方法多样，各具特点。传统检测方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，是国际上通用的鉴定细菌的方法。这类培养法耗时长、灵敏度低。免疫学方法简单、方便、迅速，但是交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低。因此，为了有效地检测致病性大肠杆菌，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高、简单便捷的致病性大肠杆菌检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于致病性大肠埃希氏菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供了一种检测致病性大肠埃希氏菌的引物对，所述的引物对选自下组：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对；和SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6所示的引物对。在另一优选例中，所述的引物对选自下组：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；和SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对。在另一优选例中，所述的引物对为：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对在另一优选例中，所述引物对用于实时荧光定量PCR。本专利技术的第二方面，提供了一种检测致病性大肠埃希氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对。在另一优选例中，所述试剂盒还包括探针序列，所述探针序列如SEQIDNO.:11所示。在另一优选例中，所述试剂盒还包括：Taq酶、dNTP、和/或Mg2+。本专利技术的第三方面，提供了如本专利技术第一方面所述的引物对、或本专利技术第二方面所述的试剂盒的用途，用于致病性大肠埃希氏菌的检测。在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的的。在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。本专利技术的第四方面，提供了一种检测致病性大肠埃希氏菌的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测样本，并从所述待检测样本中提取DNA；(2)使用本专利技术第二方面所述的试剂盒检测步骤(1)提取得到的DNA，从而判断所述待检测样本中是否存有致病性大肠埃希氏菌。在另一优选例中，所述方法为荧光定量PCR检测方法。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了各引物对针对感染血液DNA探针检出灵敏度检测结果。图2显示了使用引物对1针对致病性大肠埃希氏菌标准品的灵敏度检测结果。图3显示了使用引物对1针对感染血液样本中致病性大肠埃希氏菌DNA模板的灵敏度检测结果。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，获得了能够用于致病性大肠埃希氏菌检测的引物对和探针，对目标菌株的DNA进行实时荧光PCR检测时，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。本专利技术还提供了用于致病性大肠埃希氏菌检测的试剂盒。在描述本专利技术之前，应当理解本专利技术不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本专利技术的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本专利技术的实施或测试中可以使用与本专利技术中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本专利技术的引物对在致病性大肠埃希氏菌DNA时能够同时具备高灵敏度和高特异性，从而能准确而灵敏地检测产品，例如环境样品、食品、保健品、化妆品中的致病性大肠埃希氏菌含量，或者血液样本、组织样本中是否含有致病性大肠埃希氏菌，从而用于感染性疾病的诊断。本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。探针可以处于液相中，也可以固定于固相上。本专利技术中，致病性大肠埃希氏菌引物探针设计的靶序列如下：1tttttattttttaatgtatttgtacatggagaaaataaagtgaaacaaagcactattgca61ctggcactcttaccgttactgtttacccctgtgacaaaagcccggacaccagaaatgcct121gttctggaaaaccgggctgctcagggcgatattactgcacccggcggtgctcgccgttta181acgggtgatcagactgccgctctgcgtgattctcttagcgataaacctgcaaaaaatatt241attttgctgattggcgatgggatgggggactcggaaattactgccgcacgtaattatgcc301gaaggtgcgggcggcttttttaaaggtatagatgccttaccgcttaccggg(SEQIDNO.10)表1本专利技术还提供一种检测致病性大肠埃希氏菌基因组DNA的检测试剂，所述检测试剂包含本专利技术的引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。在具体的实施方式中，本专利技术检测试剂的检测灵敏度达到1fg/μL。在本专利技术的引物对或检测试剂的基础上，本专利技术进一步提供一种检测致病性大肠埃希氏菌基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本专利技术的引物对或检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。在本专利技术的引物对的基础上，本专利技术还提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的根据本专利技术的引物对；和/或探针。在具体的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。在本专利技术的引物对的基础上，本专利技术提供利用本专利技术的引物对扩增目标产物的PCR方法。本专利技术的主要优点在于：本专利技术获得的一段能够用于致病性大肠埃希氏菌检测的引物对和探针，对目标菌株的DNA进行实时荧光PCR检测时，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。下面结合具体实施例，进一步详陈本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测致病性大肠埃希氏菌的引物对，其特征在于，所述的引物对选自下组：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对；和SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6所示的引物对。

【技术特征摘要】
1.一种检测致病性大肠埃希氏菌的引物对，其特征在于，所述的引物对选自下组：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对；和SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6所示的引物对。2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的引物对选自下组：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对；和SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对。3.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的引物对为：SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示的引物对。4.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对用于实时荧光定量PCR。5.一种检测致病性大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋振云，宋元林，周建，于秀艳，
申请(专利权)人：上海卓立生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31