本发明专利技术涉及一种用于检测受试者中的病原体的靶核酸的方法。该方法包括(a)扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且产生双链DNA，并且(b)检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。还提供了用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的试剂盒。
Method and Kit for Detecting Cell-free Pathogen-specific Nucleic Acids
The invention relates to a method for detecting target nucleic acids of pathogens in subjects. The method includes (a) amplifying the target nucleic acid sequence, in which the target nucleic acid is derived from the acellular component of the blood sample of the subject and generates double-stranded DNA, and (b) detecting the double-stranded DNA, the presence of which indicates the presence of the target nucleic acid in the subject. A kit for detecting target nucleic acids from pathogens in subjects is also provided.
【技术实现步骤摘要】
用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒本申请是申请号为201280026842.3、申请日为2012年4月2日、专利技术名称为“用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2012/031814的国际申请的中国国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2011年4月1日的美国临时申请号61/470,774的优先权。相关申请的交叉引用本申请要求2011年4月1日提交的申请号为61/470774的美国临时专利申请的优先权，其内容均通过引用全部并入本文，并可用于所有目的。专利技术的
本专利技术总体涉及用于检测受试者中病原体的特异性核酸的方法和试剂盒。专利技术背景许多病原体的感染都会引起严重的疾病。对病原体的早期检测在和这些病原体相关的疾病的诊断和治疗中起重要作用。结核病是一种由各种分枝杆菌菌株(通常为一种结核杆菌)引起的常见感染性疾病。这种感染性疾病在许多情况下是致命的。结核病的明确诊断是通过微生物采样培养以识别在临床样本(如痰或脓)中的结核分枝杆菌而得出。其他测试，如放射显影(如，胸部X光检查)，结核菌素皮肤试验，以及伽玛干扰素释放试验(IGRA)可以得出一个非确定性的诊断。聚合酶链式反应(PCR)技术已被用于检测样本(例如痰，尿，胃液抽吸物，脑脊液，胸膜液，血，并脓肿，骨髓，活检样本，切除的组织或支气管活检材料)中的结核分枝杆菌(TB)，以提供结核病的早期诊断。已经有报道在一项研究中从所有8例确诊的肺结核患者的外周血白细胞里检测到结核分枝杆菌的DNA。而在另一项研究中，41例确诊的结核病患者中有39例检测到结核分枝杆菌的DNA。请参见Schluger等，Lancet344：232-3(1994)；Cordos等，Lancet347：1082-5(1996)。然而，这些实验的结果遭到了其他使用血液PCR检测结核病的研究人员的批评。参见，Kolk等，Lancet344：694(1994)；Palenque等，Lancet344：1021(1994)；Aguado等，Lancet347：1836-7(1996)。虽然在过去二十年中已经为使用“血液结核分枝杆菌PCR”方法检测结核病作出了巨大努力，但仍只获得了非常有限的成功。在体内，大部分的核酸(如DNA和RNA)都存在于细胞内，但是也有少量的核酸被发现自由流动于个体的血浆中。这些DNA和RNA分子被认为是由接近死亡的细胞在分解过程中释放到血液中的。通过检测来源于DNA病原体的靶RNA可以区分潜伏性感染和活动性感染。例如，通过检测来源于结核分枝杆菌(TB)的靶RNA可以区分活动性结核感染和潜伏性结核感染并用于结核病的诊断。循环核酸(CNA)是在血液中发现的DNA或RNA。自从可以通过孕妇外周血检测胎儿DNA，已经可以在宿主外周血中检测来源于肿瘤、异种移植、器官移植和寄生虫的无细胞DNA和RNA。作为一种非侵入性诊断方法，CNA检测已被尝试应用于各种临床状况的诊断。但是，它还没有被成功应用于高灵敏度和高特异性地检测病原体特异性循环核酸。因此，仍然需要一种具有高灵敏度和高特异性的用于检测个体内病原体(例如，结核分枝杆菌)的早期检测方法。专利技术概述本专利技术涉及用于检测受试者中无细胞的病原体特异性核酸的方法及相关的检测试剂盒。根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的方法。该方法包括扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且由此产生双链DNA。该方法进一步包括检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。所述无细胞组分优选为血清，血浆，胸腔积液，或CSF，更优选为血清或血浆。所述病原体可以选自以下组：细菌，真菌和寄生虫。优选地，所述病原体是结核分枝杆菌(TB)。所述靶核酸可以是DNA或RNA。靶核酸的核酸序列可以是来源于结核分枝杆菌(TB)H37Rv的DNA，例如，所述DNA序列选自以下组：IS6110，IS1084，MPT64，rrs，esat6，类esat6，MDR，rpoB，katG，iniB和它们的片段。所述双链DNA可以少于100个碱基，优选为40-60个碱基。所述来源于受试者的血液样本的量可以为0.2-10毫升，优选为2-5毫升。所述靶核酸的核酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，转录介导的扩增技术(TMA)，或连接酶链式反应(LCR)进行扩增。优选地，所述核酸序列通过PCR扩增。所述双链DNA可用检测试剂进行检测。检测试剂可以是荧光标记的探针(例如，Taqman探针，分子信标(Molecularbeacon)，或蝎型探针(Scorpin)，嵌入性荧光染料或延伸发光(LightUponExtension)(LUX)引物。优选地，所述检测试剂是嵌入性荧光染料。所述嵌入性荧光染料可以选自以下组：SYBR绿，CytoGreen，EvaGreen，BOXTO和SYT09。该方法还可以进一步包括浓缩在无细胞组分中的所述靶核酸。该方法可以进一步包括从血液样本中制备所述无细胞组分。该方法可以进一步包括在受试者中诊断结核感染。该结核感染可以是活动性的或潜伏性的。根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的试剂盒。该试剂盒包含一种或多种用于扩增所述靶核酸序列以产生双链DNA的试剂或材料，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分。该试剂盒进一步包含了一种或多种用于检测所述双链DNA的试剂或材料。所述病原体可以选自以下组：细菌，真菌和寄生虫。优选地，所述病原体是结核分枝杆菌(TB)。所述靶核酸可以是DNA或RNA。靶核酸的核酸序列可以是来源于结核分枝杆菌(TB)H37Rv的DNA，例如，所述DNA序列选自以下组：IS6110，IS1084，MPT64，rrs，esat6，类esat6，MDR，rpoB，katG，iniB和它们的片段。所述一种或多种用于扩增靶核酸序列的试剂或材料包括一对引物，并且所述双链DNA具有40-60个核苷酸。所述引物可以具有序列GGTCAGCACGATTCGGAG(SEQIDNO：1)和GCCAACACCAAGTAGACGG(SEQIDNO：2)。所述一种或多种用于检测所述双链DNA的试剂或材料包括荧光标记的探针(例如，Taqman探针，分子信标，或蝎型探针)，嵌入性荧光染料或延伸发光(LUX)引物。优选地，所述检测试剂是嵌入性荧光染料。所述嵌入性荧光染料可以选自以下组：SYBR绿，CytoGreen，EvaGreen，BOXTO和SYT09。附图的简要说明图1显示了使用TB基因组DNA作为模板的短qPCR产物的(A)扩增曲线和(B)熔解曲线。图2显示了用于检测猴血浆中TB的短qPCR产物的(A)扩增曲线和(B)熔解曲线。图3显示了用于检测人个体血浆中TB的短qPCR产物的(A)扩增曲线和(B)熔解曲线。所述人个体的血浆来源于6例被确诊感染结核(TB，箭头A)或2例没有临床诊断为肺结核(非结核，箭头B)的个体。图4显示了用于检测人个体样本中TB的短qPCR产物的(A)扩增曲线和(B)熔解曲线。所述人个体样本来源于胸腔积液的无细胞组分本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的方法，包括(a)扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且产生双链DNA，并且(b)检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。
【技术特征摘要】
2011.04.01 US 61/470,7741.一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的方法，包括(a)扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且产生双链DNA，并且(b)检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞组分是血清。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞组分是血浆。6.根据权利要求1的方法，其中所述病原体是结核分枝杆菌(TB)。7.根据权利要求1的方法，其中所述核酸序列来源于结核分枝杆菌(TB)H37Rv的DNA序列，所述DNA序列选自以下组：IS6110，IS1084，MPT64，rrs，esat6，类esat6，MDR，rpoB，katG,iniB和它们的片段。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链DNA具有40-60个碱基。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样本的体积为0.2-10毫升。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列由聚合酶链式反应(PCR)扩增。11.根据权利要求1的方法，其中双链DNA是由检测试剂检测，所述检测试剂选自以下组：荧光标记探针，嵌入性荧光染料和延伸发光(LUX)引物。12.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱明伟，
申请(专利权)人：澳康姆生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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