堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测堪萨斯分枝杆菌的LAMP引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB。本发明专利技术还提供包含上述引物组的检测试剂盒及其检测方法。检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、阴阳性对照和荧光染料(或显色剂)。检测方法是通过提取待测样品的DNA，然后在DNA聚合酶和引物组存在的情况下，对样品DNA模板在65℃左右进行等温扩增，最后通过实时荧光定量PCR仪检测荧光或加入显色剂观察管内颜色变化来确定待检样品中是否含有堪萨斯分枝杆菌。本发明专利技术提供的试剂盒和检测方法具有很好的特异性和灵敏性，扩增快速、高效，易于操作，可用于临床标本中堪萨斯分枝杆菌的快速检测。

LAMP Detection Primer Group, Kit and Detection Method of Mycobacterium Kansas

The present invention provides a LAMP primer group for detecting Mycobacterium Kansas, including external primer F3, external primer B3, internal primer FIP, internal primer BIP, loop primer LF and loop primer LB. The invention also provides a detection kit containing the above primers and a detection method thereof. The detection kit includes primer solution, reaction solution, DNA polymerase, negative-positive control and fluorescent dye (or chromogenic agent). The detection method is to extract the DNA of the sample to be tested, and then to amplify the DNA template of the sample at about 65 C in the presence of DNA polymerase and primer group. Finally, to determine whether the sample contains Mycobacterium Kansas by real-time fluorescence quantitative PCR or adding chromogenic agent to observe the color change in the tube. The kit and detection method provided by the invention have good specificity and sensitivity, rapid amplification, high efficiency and easy operation, and can be used for rapid detection of Mycobacterium Kansas in clinical specimens.

【技术实现步骤摘要】
堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及堪萨斯分枝杆菌的快速检测，具体为一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
堪萨斯分枝杆菌是一种慢生长非结核分枝杆菌，属于Runyon分类法中的Ⅰ群，即光产色群。直接涂片显微镜观察见该菌比较粗大，亦可见颗粒状杆菌形态和菌体栅栏样排列。堪萨斯分枝杆菌在合适的培养基(如米氏培养基、罗氏培养基)上生长大约6周后，可形成粗糙或光滑的中等大小的黄色菌落，随着培养时间延长，菌落颜色慢慢转变为红橙色。堪萨斯分枝杆菌可存在于环境中的水和土壤中，最常见的来源是自来水，一般不会感染人类引起疾病和造成人间传播。但在特殊情况下，如有基础性肺病或患者免疫力低下时，该菌可引起肺部疾病、肺外疾病甚至全身播散性感染。堪萨斯分枝杆菌感染常见的临床症状包括咳嗽、胸痛、咯血和呼吸困难等，常见的影像学改变为单侧的上肺区段阴影，这些表现与肺结核的临床症状和影像学改变都比较类似，故此类诊断依据在堪萨斯分枝杆菌感染诊断方面都缺乏特异性。在实验室诊断方面，通过培养和生化鉴定可鉴别堪萨斯分枝杆菌与其它本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组，其特征在于，针对堪萨斯分枝杆菌特有的ECHT基因编码序列设计并优化，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：外引物F3：5’‑GACTGTTGGCGAGTTGGT‑3’外引物B3：5’‑GTCCTGGAACGTCTGCTC‑3’内引物FIP：5’‑GGTGTGGCACATTGCGACAGATATAACTCGAACAGCAC‑3’内引物BIP：5’‑CGGATCAGCGGTATGACGGCCGGCTGCCCGATTAGAT‑3’环引物LF：5’‑GTTCTGCGACGGCGA...

【技术特征摘要】
1.一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组，其特征在于，针对堪萨斯分枝杆菌特有的ECHT基因编码序列设计并优化，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：外引物F3：5’-GACTGTTGGCGAGTTGGT-3’外引物B3：5’-GTCCTGGAACGTCTGCTC-3’内引物FIP：5’-GGTGTGGCACATTGCGACAGATATAACTCGAACAGCAC-3’内引物BIP：5’-CGGATCAGCGGTATGACGGCCGGCTGCCCGATTAGAT-3’环引物LF：5’-GTTCTGCGACGGCGATTC-3’环引物LB：5’-GGGATGCGTTGTCCACCA-3’。2.根据权利要求1所述的LAMP检测引物组，其特征在于，其特征在于，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:4:4:2:2。3.一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组。4.根据权利要求3堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)LAMP反应液；(2)荧光染料或显色剂；(3)阳性对照和阴性对照。5.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；LAMP反应液包括dNTP、反应缓冲液、MgSO4和甜菜碱。6.根据权利要求4所述的基于智能恒温扩增技术检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有堪萨斯分枝杆菌ECHT基因片段的载体克隆，阴性对照为不含堪萨斯分枝杆菌ECHT基因片段的水或其他溶剂。7.根据权利要求3堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为SYBRgreen，所述显色剂为羟基萘酚蓝。8.根据权利要求3堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：(1)引物组：包含权利要求1所述的LAMP检测引物组，外引物、内引物和环引物的浓度均为10μM；(2)反应液：包括dNTP、反应缓冲液、MgSO4和甜菜碱，使用时需等倍稀释；(3)BstDNA聚合酶：浓度为0.16U/μL；(4)荧光染料或显色剂：荧光染料为SYBRgreen，显色剂为羟基...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘厚明，尹小毛，单万水，
申请(专利权)人：深圳市第三人民医院深圳市肝病研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44