狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用。所述的激活素A蛋白由两个狐亚科激活素βA亚基组成，从狐亚科动物中分离得到其基因序列后利用分子生物学及细胞生物学的方法纯化出具有生物活性的蛋白。激活素A蛋白在狐亚科动物中的研究还比较少，本发明专利技术分离得到了其基因序列，并提高了其高纯度蛋白的表达方法，可为相关研究提供研究基础和新的思路，大大增加了激活素A蛋白的研究与应用前景。

Activator A Protein of Fox Subfamily and Its Preparation and Application

The invention relates to the field of molecular biology, in particular to a fox subfamily activin A protein and its preparation and application. The activin A protein consists of two subunits of fox subfamily activin beta A. The gene sequence of the activin A protein was isolated from Fox subfamily animals, and the protein with biological activity was purified by molecular biology and cell biology methods. Activin A protein is seldom studied in fox subfamily animals. The present invention isolates its gene sequence and improves the expression method of its high purity protein. It can provide research basis and new ideas for related research, and greatly increases the research and application prospect of activin A protein.

【技术实现步骤摘要】
狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种狐亚科激活素A蛋白及其制备与应用。
技术介绍
激活素(Actvin,ACT)，又名活化素，是Vale等和Ling等首先从猪卵泡液中分离纯化出来的一种糖蛋白激素，因能与抑制素(Inhibin,INH)分别特异性促进和抑制垂体细胞分泌卵泡刺激素(FollicleStimulatingHormone，FSH)而得名，属于转化生长因子β超家族成员。激活素主要是由卵巢颗粒细胞和胎盘合成分泌，由于其具有特异性地促进垂体细胞分泌及合成卵泡刺激素的生物学活性，因而被命名为激活素。ACT同INH均为两个亚基构成的二聚体。ACT由β亚单位构成，包括同源二聚体ACTA(βA-βA)和ACTB(βB-βB)或异源二聚体ACTAB(βA-βB)。其中βA亚基含量最多。三种分子结构的激活素具有类似的生物学活性，其作用的特异性与其受体后信号传导的组织差异有关。因ACTA的生理作用更为广泛，对机体整个生命过程均有重要的作用，成为近年来备受关注的新型细胞因子，故目前对ACTA的研究较多。狐狸(Vulpesvulpes)属于中型的杂食性哺乳动物，属于犬科。它作为重要的毛皮动物被大量饲养。目前国内外关于狐狸卵母细胞的体外成熟的研究并不顺利，主要原因是狐狸卵母细胞成熟过程中调节因子的种类及机制知之甚少。众所周知ACTA在哺乳动物卵母细胞成熟过程中发挥了重要作用。但ACTA是否有助于狐狸卵母细胞的体外成熟的研究一直没有被进行，主要是因为目前国内对狐亚科ACTA的研究还较少，尚无狐亚科ACTA蛋白质与cDNA序列的报道，这为进一步探讨研究狐亚科ACTA的功能、其表达的时空特异性、相关信号通路及对狐亚科繁殖力等的研究都将造成了障碍。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新颖的激活素A蛋白，并对其制备方法与功能进行了研究。所述的激活素A蛋白由两个狐亚科激活素βA亚基(氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)组成，从狐亚科动物中分离得到。激活素A蛋白在狐亚科动物中的研究还比较少，本专利技术分离得到了其基因序列，并提高了其高纯度蛋白的表达方法，可为相关研究提供研究基础和新的思路，大大增加了激活素A蛋白的研究与应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中北极狐INHBA基因扩增结果；M.DNA相对分子质量标准(DL2000)；1.INHBA基因扩增产物；2.阴性对照；图2为本专利技术一个实施例中pcDNA4/INHBA-Fox质粒的酶切鉴定结果；M1.DNA相对分子质量标准(DL10000)；1.INHBA基因扩增产物；2.BamHI单酶切pcDNA4/myc-His空质粒；3.BamHI单酶切pcDNA4/INHBA-Fox重组质粒；4.BamHI和EcoRI双酶切pcDNA4/INHBA-Fox重组质粒；M2.DNA相对分子质量标准(DL2000)；图3为本专利技术一个实施例中INHBA基因在CHO细胞中瞬时表达的免疫荧光图；A1,A2,A3为CHO细胞转染pcDNA4/INHBA-Fox后荧光显微镜照片(A1：DAPI染核，A2：INHBA-His融合蛋白，A3：重叠后照片)；B1,B2,B3为CHO细胞转染pcDNA4/myc-His后荧光显微镜照片(B1：DAPI染核，B2：阴性对照，B3：重叠后照片)；图4为本专利技术一个实施例中INHBA基因在CHO细胞中瞬时表达的WesternBlot鉴定结果；1转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞破碎产物；2转染空载体pcDNA4/myc-His的CHO细胞破碎产物；M蛋白maker；图5为本专利技术一个实施例中SDS-PAGE检测激活素A的表达；1转染空载体pcDNA4/myc-His的CHO细胞培养液上清；2转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞培养液上清(非还原性SDS-PAGE上样缓存液变性)；图6为本专利技术一个实施例中Westernblot检测激活素A的表达；A转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞培养液上清(非还原性SDS-PAGE上样缓存液变性)；B转染重组质粒pcDNA4/INHBA-Fox的CHO细胞培养液上清(还原性SDS-PAGE上样缓存液变性)；图7为本专利技术一个实施例中前体和成熟形式的激活素的示意图；图8为本专利技术一个实施例中检测激活素A对SMAD2/3磷酸化的影响；图9为本专利技术一个实施例中激活素A对小鼠颗粒细胞细胞Aromatase和StAR表达量的影响；A实时荧光定量PCR检测P450aromatase和StARmRNA表达量水平；BWesternBlot检测P450aromatase和StAR蛋白表达量水平。具体实施方式除非另有限定，本专利技术使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本专利技术所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本专利技术提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。本专利技术涉及一种狐亚科激活素βA亚基，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及一种狐亚科激活素A蛋白，其由两个如上所述的狐亚科激活素βA亚基组成。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及分离的核酸，其编码权利如上所述激活素βA亚基；在本文中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸为DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:2或3所示。本专利技术所述核酸还包括与本专利技术所提供序列高度同源的功能等价体序列。所述高度同源的功能等价体序列包括在严格条件下能够与具有SEQIDNO：2或3所示的序列的DNA杂交的DNA序列。本专利技术中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mMNaCl、40mMPIPES(pH6.4)和1mMEDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。功能等价体序列还包括与SEQIDNO：2或3所示序列有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，且能够表达具有激活素活性蛋白的基因序列，可以从任何生物体中分离获得。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.狐亚科激活素βA亚基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.狐亚科激活素βA亚基，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.狐亚科激活素A蛋白，其由两个权利要求1所述的狐亚科激活素βA亚基组成。3.分离的核酸，其编码权利要求1所述激活素βA亚基。4.根据权利要求3所述的核酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:2或3所示。5.载体，其包含权利要求3或4所述的核酸；优选的，所述载体选自pEASY-BluntSimpleCloningVector和/或pcDNA4/myc-His。6.宿主细胞，其被权利要求3或4所述的核酸或权利要求5所述的载体所转化；优选的，所述宿主细胞选自CHO细胞系。7.一种制备狐亚科激活素βA亚基或狐亚科激活素A蛋白的方法，其特征在于，包括：在培养基中培养权利要求6所述的宿主细胞，从所培养的宿主细胞中回收如此产生的蛋白。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，从所培养的宿主细胞中回收的蛋白带有histag，所述方法还包括将所述蛋白经亲和层析柱处理；优选的，所述亲和层...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇飞，许保增，曹满媛，赵伟刚，李晓霞，刁云飞，曹新燕，赵蒙，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22