一种酮康唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种酮康唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的酮康唑人工抗原为将式I所示的酮康唑半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明专利技术所提供酮康唑人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于酮康唑抗体的制备，以及酮康唑药物残留检测具有重大价值。

A ketoconazole hapten and artificial antigen and its preparation method and Application

The invention discloses a ketoconazole hapten, an artificial antigen and a preparation method and application thereof. The ketoconazole artificial antigen provided by the invention is an antigen obtained by coupling ketoconazole hapten shown in formula I with carrier protein. The synthetic method of ketoconazole artificial antigen provided by the invention is simple, high purity and high yield, and has great value for the preparation of ketoconazole antibody and the detection of ketoconazole drug residues.

【技术实现步骤摘要】
一种酮康唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
本专利技术属于药物残留快速检测领域，涉及一种酮康唑人工抗原及其制备方法与应用。
技术介绍
酮康唑（Ketoconazole，KCZ）为咪唑类抗真菌药，对隐球菌、着色真菌、念珠菌、球孢子菌、组织胞浆菌、皮炎芽生菌、毛发癣菌均具有抗菌活性，大剂量对曲霉菌、孢子丝菌也有作用，在体外，酮康唑对金黄葡萄球菌、放线菌、肠球菌等革兰氏阳性菌也有抗菌活性。在猪、牛、羊、鸡、宠物等动物养殖上作为抗真菌药广泛应用，但酮康唑具有一定毒性，有报道会造成肝胆系统损害、全身性损害、胃肠系统损害、中枢及外周神经系统损害、皮肤及其附件损害等。目前酮康唑的检测方法主要有高效液相色谱法、反相高效液相色谱法，虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础、最关键的步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酮康唑人工抗原及其制备方法与应用。本专利技术所提供的酮康唑人工抗原是在酮康唑半抗原的基础上构建所得的抗原。所述酮康唑半抗原属于本专利技术的保护范围，其结构如式I所示。式I本专利技术所提供的制备所述酮康唑半抗原的方法，具体可包括如下步骤：乙酰酮康唑溶解于吡啶溶液，加入琥珀酸酐反应，获得反应液。所述乙酰酮康唑、吡啶、琥珀酸酐的配比为1000mg：25ml：411.52mg，所述反应温度为20-24℃，所述反应时间为5h；反应液在冰水中析出白色固体，过滤后的滤饼经25ml水洗、鼓风干燥得到式I所述的酮康唑半抗原。所述鼓风干燥的温度为50℃，时间为5-6小时。得到酮康唑半抗原（式I）1144.25mg。在酮康唑半抗原的基础上构建所得的酮康唑抗原也属于本专利技术的保护范围。所述酮康唑抗原，为将所述酮康唑半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本专利技术的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。所述酮康唑抗原的制备方法也属于本专利技术的保护范围。所述酮康唑抗原的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述酮康唑半抗原（式I）与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述酮康唑抗原。其中，所述酮康唑半抗原（式I）与所述载体蛋白偶联的摩尔比为16.2：1。在本专利技术中，所述酮康唑抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：（1）将所述酮康唑半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3h，得到溶液I；其中，所述酮康唑半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为26.39mg：1.5mL：21.5mg：13mg。（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6-50mg：3.5mL；其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5mL；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5mL；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用磷酸盐缓冲液（0.01MPBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述酮康唑抗原。所述酮康唑半抗原（式I）或所述酮康唑抗原在定性或定量检测酮康唑中的应用也属于本专利技术的保护范围。利用所述酮康唑抗原制备的抗体也属于本专利技术的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。本专利技术所提供的酮康唑半抗原，以及所述酮康唑抗原，合成方法简单、纯度高、产率高，对于酮康唑抗体的制备，以及酮康唑药物残留检测具有重大价值。附图说明图1为酮康唑半抗原质谱图。图2为BSA的MALDI-TOF-MAS图。图3为酮康唑BSA复合物的MALDI-TOF-MAS图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、酮康唑半抗原的制备一、酮康唑半抗原的制备50ml圆底烧瓶中加入去乙酰酮康唑1000mg，25ml的吡啶搅拌15min完全溶解后于20-24℃加入琥珀酸酐411.52mg，20-25℃磁力搅拌反应5小时。后将反应液滴加到100ml冰水中析出白色固体，过滤，滤饼用25ml水洗，收集滤饼50℃鼓风干燥5-6小时得到酮康唑半抗原1144.25mg。反应方程式如下：二、酮康唑半抗原的结构鉴定对所得1144.25mg酮康唑半抗原进行质谱检测（图1），结果显示其化学结构式如式I所示（MW=589.47），即为酮康唑半抗原。式I实施例2、酮康唑人工抗原的制备及结构鉴定一、酮康唑人工抗原的制备1、免疫原的合成（1）将26.39mg酮康唑半抗原用1.5mLDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC21.5mg溶解后再加入NHS13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。（2）称取BSA50mg溶于3.5mL0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1mL/min），500rpm搅拌反应24h.（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L0.01MPBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5mL/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。2、包被原的合成（1）将26.39mg酮康唑半抗原用1.5mLDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC21.5mg溶解后再加入NHS13mg，室温搅拌（500rpm）活化2-3h。（2）称取OVA33.6mg溶于3.5mL0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温0-4℃，1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入（1mL/min），500rpm搅拌反应24h。（3）将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L0.01MPBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次（早中晚各一次），共计换液9次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5mL/管分装，将抗原编号，-20℃保存备用。二、酮康唑人工抗原的鉴定免疫原MALDI-TOF-MS鉴定结果显示偶联比为：R=（74172.401-64632.360）/589.47=16.2（图2和图3）。即免疫原中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酮康唑半抗原，其结构如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种酮康唑半抗原，其结构如式I所示：式I。2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：乙酰酮康唑溶解于吡啶溶液，加入琥珀酸酐反应，获得反应液；所述乙酰酮康唑、吡啶、琥珀酸酐的配比为1000mg：25ml：411.52mg，所述反应温度为20-24℃，所述反应时间为5h；反应液在冰水中析出白色固体，过滤后的滤饼经25ml水洗、鼓风干燥得到式I所述的酮康唑半抗原1144.25mg；所述鼓风干燥的温度为50℃，时间为5-6小时。3.酮康唑抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。4.根据权利要求3所述的酮康唑抗原，其特征在于：所述载体蛋白可以是牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白或兔血清蛋白。5.权利要求3或4所述的酮康唑抗原的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述酮康唑抗原；权利要求1所述化合物与所述载体蛋白偶联的摩尔比为19.5：1。6.根据权利要求5所述的酮康唑抗原的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：（1）将所述酮康唑半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂靖东，秦誉，吴雨洋，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11