一种检测半胱氨酸的新型荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测半胱氨酸的新型荧光探针及其制备方法和应用，该探针为4‑(7‑二乙氨基香豆素‑3‑乙烯基)‑1‑(4‑丙烯酰氧基)苄基吡啶溴盐。制备方法包括：对羟基苄醇与丙烯酰氯反应；所得4‑(羟甲基)丙烯酸苯酯与三溴化磷反应，得到4‑(溴甲基)丙烯酸苯酯；4‑二乙氨基水杨醛与丙二酸二乙酯反应所得7‑二乙氨基香豆素利用Vilsmeier反应；所得7‑二乙氨基香豆素‑3‑甲醛与4‑甲基吡啶脱水缩合反应；所得7‑二乙氨基‑3‑(4‑吡啶基)乙烯基香豆素与4‑(溴甲基)丙烯酸苯酯反应，得到上述新型荧光探针。该探针对半胱氨酸的检测表现出较高的选择性和灵敏度。

A Novel Fluorescent Probe for Cysteine Detection and Its Preparation and Application

The invention discloses a novel fluorescent probe for detecting cysteine and its preparation method and application. The probe is 4 (7 diethylaminocoumarin 3 vinyl)(4 acryloxy) benzyl pyridine bromide. The preparation methods include: reaction of p-hydroxybenzyl alcohol with acryloyl chloride; reaction of 4 (hydroxymethyl) phenyl acrylate with phosphorus tribromide to obtain 4 (bromomethyl) phenyl acrylate; reaction of 4 diethylaminosalicylic aldehyde with diethyl malonate to obtain 7 diethylaminocoumarin by Vilsmeier reaction; dehydration and condensation reaction of 7 diethylaminocoumarin 3 formaldehyde with 4 methylpyridine The new fluorescent probe was obtained by the reaction of 7 diethylamino 3 (4 pyridyl) vinyl coumarin with 4 (bromomethyl) phenyl acrylate. The probe showed high selectivity and sensitivity for the detection of cysteine.

【技术实现步骤摘要】
一种检测半胱氨酸的新型荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于分析化学
，尤其涉及一种检测半胱氨酸的新型荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
生物硫醇如半胱氨酸(Cys)，谷胱甘肽(GSH)，同型半胱氨酸(Hcy)在生理和病理过程中起至关重要的作用。然而，细胞内硫醇水平的改变与很多疾病密切相关。体内缺乏半胱氨酸会导致多种病症，如儿童生长缓慢，肝损伤和皮肤损伤等。谷胱甘肽(GSH)在细胞内含量在1mM到15mM之间，是细胞内最富裕的硫醇，在维持细胞的氧化还原动态平衡中起着重要作用。血液中同型半胱氨酸的浓度增加会导致维生素B12的缺失和老年痴呆症。由于半胱氨酸，谷胱甘肽和同型半胱氨酸具有不同生理和病理功能，因此，检测半胱氨酸而不受谷胱甘肽和同型半胱氨酸显得尤为重要。开发检测半胱氨酸的荧光探针越来越受到重视，由于其具有选择性好、灵敏度高、快速简便等优点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种选择性好、灵敏度高、快速简便的检测半胱氨酸的新型荧光探针，还相应提供该检测半胱氨酸的新型荧光探针的制备方法及应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种检测半胱氨酸的新型荧光探针，所述检测半胱氨酸的新型荧光探针为4-(7-二乙氨基香豆素-3-乙烯基)-1-(4-丙烯酰氧基)苄基吡啶溴盐，结构式如式(1)：作为一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种上述的检测半胱氨酸的新型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)对羟基苄醇与丙烯酰氯反应，得到4-(羟甲基)丙烯酸苯酯，结构式如式(4)：(2)步骤(1)所得的4-(羟甲基)丙烯酸苯酯与三溴化磷反应，得到4-(溴甲基)丙烯酸苯酯，结构式如式(3)：(3)4-二乙氨基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到7-二乙氨基香豆素，结构式如式(6)：(4)步骤(3)所得的7-二乙氨基香豆素进行维尔斯迈尔(Vilsmeier)反应，得到7-二乙氨基香豆素-3-甲醛，结构式如式(5)：(5)步骤(4)所得的7-二乙氨基香豆素-3-甲醛与4-甲基吡啶通过脱水缩合反应，得到7-二乙氨基-3-(4-吡啶基)乙烯基香豆素，结构式如式(2)：(6)步骤(2)所得的4-(溴甲基)丙烯酸苯酯与步骤(5)所得的7-二乙氨基-3-(4-吡啶基)乙烯基香豆素反应，得到式(1)所示的化合物。优选的，所述步骤(1)的具体过程为：将碳酸钾溶于丙酮和水的混合溶液中(丙酮和水的体积比4:1)，再加入丙烯酰氯，冷却至0℃，控温0℃缓慢滴加对羟基苄醇溶液，滴加完后控温0℃反应4～6h，反应完后，用饱和氯化钠溶液淬灭，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸发溶剂后，过硅胶色谱柱纯化，得产物为4-(羟甲基)丙烯酸苯酯。优选的，所述对羟基苄醇与丙烯酰氯的摩尔比为1∶0.8～1.0。优选的，所述步骤(2)的具体过程为：将4-(羟甲基)丙烯酸苯酯用二氯甲烷溶解，在氩气保护下，控温-5～0℃低温加入三溴化磷，将反应液室温反应14～18h后，将反应液倒入饱和碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥后，蒸发溶剂后，过硅胶色谱柱纯化，得产物为4-(溴甲基)丙烯酸苯酯。优选的，所述4-(羟甲基)丙烯酸苯酯与三溴化磷的摩尔比为1∶1.0～2.0。优选的，所述步骤(3)的具体过程为：将4-二乙氨基水杨醛与丙二酸二乙酯溶解于无水乙醇中，并加入哌啶作为催化剂，回流反应6～10h，反应完毕，蒸发溶剂后，加入冰醋酸和浓盐酸，回流反应6～10h，反应完毕，将反应液倒入冰水中，用40％氢氧化钠溶液调pH为5.0，有大量固体析出，并搅拌30～60min，减压过滤得到粗产物，用甲苯重结晶，得产物为7-二乙氨基香豆素。优选的，所述4-二乙氨基水杨醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1∶2.0～2.5。优选的，所述步骤(4)的具体过程为：在氩气保护下，将三氯氧磷缓慢滴加至无水N,N-二甲基甲酰胺中，滴加完后室温反应30～60min得Vilsmeier试剂，然后将7-二乙氨基香豆素用N,N-二甲基甲酰胺后缓慢滴加至上述反应液中，滴加完后，控温25～80℃反应12～18h，反应完毕，将反应液倒入冰水中，用20％氢氧化钠溶液调至有大量固体析出，减压过滤得到粗产物，用无水乙醇重结晶，得产物为7-二乙氨基香豆素-3-甲醛。优选的，所述7-二乙氨基香豆素利用Vilsmeier反应的温度为25～80℃。优选的，所述步骤(5)的具体过程为：将7-二乙氨基香豆素-3-甲醛和4-甲基吡啶溶于无水N,N-二甲基甲酰胺中，并加入对甲苯磺酸为脱水剂，回流反应4～8h，反应完毕，将反应液倒入冰水中，搅拌10～30min，有固体析出，减压过滤得到粗产物，过硅胶色谱柱纯化，得产物为7-二乙氨基-3-(4-吡啶基)乙烯基香豆素。优选的，所述7-二乙氨基香豆素-3-甲醛与4-甲基吡啶的摩尔比为1∶1.0～2.0。优选的，所述步骤(6)的具体过程为：将4-(溴甲基)丙烯酸苯酯与7-二乙氨基-3-(4-吡啶基)乙烯基香豆素溶于乙腈中，加热至80～100℃反应6～12h，反应完毕，冷却至室温，加入石油醚有固体析出，减压过滤，得到式(1)所示的化合物。优选的，所述4-(溴甲基)丙烯酸苯酯与7-二乙氨基-3-(4-吡啶基)乙烯基香豆素的摩尔比为1∶0.5～1.0。作为一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种上述的检测半胱氨酸的新型荧光探针或上述的制备方法制得的检测半胱氨酸的新型荧光探针的应用，将所述半胱氨酸荧光探针与磷酸盐缓冲液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)的缓冲液混合，再加入待测溶液中，得到混合溶液，利用两个不同发射波长处荧光强度变化来检测半胱氨酸的存在与否。优选的，所述待测溶液中无半胱氨酸时，所述反应溶液的最大荧光发射波长位于644nm处，当加入半胱氨酸后，所述反应溶液的539nm处的荧光减弱，最大荧光发射波长蓝移至539nm处。优选的，所述检测半胱氨酸的新型荧光探针检测半胱氨酸的检出浓度下限为：46.7nM。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术的一种检测半胱氨酸的新型荧光探针是以丙烯酰基为识别单元的荧光探针，实践表明，本专利技术的荧光探针分子在对半胱氨酸进行检测时表现出了较高的选择性和灵敏度。3、本专利技术的一种检测半胱氨酸的新型的制备方法，关键中间体4-(溴甲基)丙烯酸苯酯为首次报道，且后处理过程简单，适于工业化生产。附图说明图1为实施例1的式(1)所示的化合物(即检测半胱氨酸的新型荧光探针)的合成路线图。图2为实施例1制备的式(3)所示的化合物的1HNMR图谱。图3为实施例1制备的式(3)所示的化合物的13CNMR图谱。图4为实施例1制备的式(3)所示的化合物的ESI-MS图谱。图5为实施例1制备的式(1)所示的化合物的1HNMR图谱。图6为实施例1制备的式(1)所示的化合物的13CNMR图谱。图7为实施例1制备的式(1)所示的化合物的ESI-MS图谱。图8为不同pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物和式(2)所示的化合物的荧光强度比率(F539nm/F644nm)的影响((a)图)和不同pH值对实施例1制备的式(1)所示的化合物与Cys反应前后荧光强度比率(F539nm/F644nm)的影响((b)图)。图9为式(2)所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测半胱氨酸的新型荧光探针，其特征在于，所述检测半胱氨酸的新型荧光探针为4‑(7‑二乙氨基香豆素‑3‑乙烯基)‑1‑(4‑丙烯酰氧基)苄基吡啶溴盐，结构式如式(1)：

【技术特征摘要】
1.一种检测半胱氨酸的新型荧光探针，其特征在于，所述检测半胱氨酸的新型荧光探针为4-(7-二乙氨基香豆素-3-乙烯基)-1-(4-丙烯酰氧基)苄基吡啶溴盐，结构式如式(1)：2.一种如权利要求1所述的检测半胱氨酸的新型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：(1)对羟基苄醇与丙烯酰氯反应，得到4-(羟甲基)丙烯酸苯酯，结构式如式(4)：(2)步骤(1)所得的4-(羟甲基)丙烯酸苯酯与三溴化磷反应，得到4-(溴甲基)丙烯酸苯酯，结构式如式(3)：(3)4-二乙氨基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到7-二乙氨基香豆素，结构式如式(6)：(4)步骤(3)所得的7-二乙氨基香豆素进行维尔斯迈尔反应，得到7-二乙氨基香豆素-3-甲醛，结构式如式(5)：(5)步骤(4)所得的7-二乙氨基香豆素-3-甲醛与4-甲基吡啶通过脱水缩合反应，得到7-二乙氨基-3-(4-吡啶基)乙烯基香豆素，结构式如式(2)：(6)步骤(2)所得的4-(溴甲基)丙烯酸苯酯与步骤(5)所得的7-二乙氨基-3-(4-吡啶基)乙烯基香豆素反应，得到式(1)所示的化合物。3.根据权利要求2所述的检测半胱氨酸的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对羟基苄醇与丙烯酰氯的摩尔比为1∶0.8～1.0。4.根据权利要求2所述的检测半胱氨酸的新型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，4-(羟甲基)丙烯酸苯酯与三溴化磷的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱东建，任爱山，段振华，
申请(专利权)人：贺州学院，
类型：发明
国别省市：广西,45