一种三色凤尾蕨组培方法及其在种质保存中的应用技术

本发明专利技术提供了一种三色凤尾蕨组培方法及其在种质资源的保存中的应用，涉及植物组培技术领域。本发明专利技术所述方法以孢子为外植体，包括以下步骤：1)将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；2)将所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；3)将所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗。本发明专利技术经过160d左右可得到大量生根的三色凤尾蕨组培苗；利用本发明专利技术所述方法，增殖率达1:10，生根率为90％以上，移栽成苗率80％以上；且将增殖得到的绿色小球进行离体保存，继代周期可延长至1.5年以上。

A Tissue Culture Method of Pteris tricolor and Its Application in Germplasm Preservation

The invention provides a tissue culture method of Pteris tricolor and its application in the preservation of germplasm resources, and relates to the technical field of plant tissue culture. The method of the invention takes spores as explants, including the following steps: 1) inoculate the explants into germination medium for germination culture and obtain germination seedlings; 2) inoculate the germination seedlings into induced proliferation medium for induced proliferation culture and obtain green balls; 3) inoculate the green balls into differentiation rooting medium for differentiation rooting culture and obtain rooting tissue culture seedlings. After 160 days or so, a large number of rooted tissue culture seedlings of Pteris tricolor can be obtained. By using the method, the multiplication rate reaches 1:10, the rooting rate is over 90%, and the transplantation seedling rate is over 80%. Moreover, the green balls obtained from the multiplication can be preserved in vitro, and the subculture period can be extended to more than 1.5 years.

【技术实现步骤摘要】
一种三色凤尾蕨组培方法及其在种质保存中的应用
本专利技术属于植物组培
，具体涉及一种三色凤尾蕨组培方法及其在种质保存中的应用。
技术介绍
三色凤尾蕨(Pteristricolor)为凤尾蕨科凤尾蕨属植物，其叶柄、裂片边缘呈紫色，羽片中央具白色和玫瑰红色的宽带，从而使叶片整体形成白、红、绿的三色条纹，故此得名。三色凤尾蕨株形优美，叶片色彩斑斓，具有极高的观赏价值，是一种稀有的观赏植物。目前，三色凤尾蕨在国内仅分布于云南南部偏热带的地区，生境狭窄。凤尾蕨属的很多物种都为观赏植物，被广泛应用于园林园艺、植物造景等，该属的很多物种已经有了孢子无菌萌发、绿色小球(GGB)诱导和植株再生等方面的报道，如白玉凤尾蕨、银中斑凤尾蕨和大叶凤尾蕨等，但三色凤尾蕨的组织培养与快速繁殖鲜有报道或方案不明确，至今市场上也未见该种商品的大量出售。目前的零星市售植株主要来源于野生个体，导致这一稀有物种更加珍稀。为缓解人们对三色凤尾蕨日益增长的审美需求与野生资源日渐枯竭的矛盾，对其开展组培快繁并结合种质资源保存的工作已迫在眉睫。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种三色凤尾蕨组培方法及其在种质保存中的应用，两个月内增殖系数高达1：10以上，满足工厂化育苗的要求，同时离体保存继代周期达1.5年以上，实现该珍稀物种的离体保存。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种三色凤尾蕨的组培方法，以孢子为外植体，包括以下步骤：1)将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/L的NAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.5；2)将步骤1)所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；所述诱导增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.4mg/L的KT，0.6～1.5mg/L的2,4-D，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.5～6.5；3)将步骤2)所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗；所述分化生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括0.6～1.5mg/L的IBA，0.06～0.15mg/L的IAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，pH值为5.5～6.5。优选的，步骤1)所述接种前，还包括将孢子置于无菌水中浸泡4～8h后消毒。优选的，所述消毒包括：将浸泡后的孢子用体积分数为75％的乙醇溶液消毒5～7s，用无菌水冲洗2～5遍，用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液消毒5～10min，用无菌水水洗3～8遍。优选的，步骤1)所述萌发培养，步骤2)所述诱导增殖培养以及步骤3)所述分化生根培养的温度独立的为23±2℃，光照强度独立的为10～20μmol/(m2·s)，光照时间独立的为10～14h/d。优选的，步骤2)所述接种前，还包括将所述萌发苗分解为根、叶柄、叶片和茎尖组织。优选的，步骤3)得所述生根组培苗后，还包括炼苗和移栽。优选的，所述炼苗的时间为3～4d。优选的，所述移栽的基质包括：腐殖土和沙土，所述腐殖土和沙土的体积比为(1.5～2.6)：1。本专利技术还提供了上述组培方法在保存三色凤尾蕨种质资源中的应用，将步骤2)得到的所述绿色小球接种于离体保存培养基进行离体保存，所述离体保存培养基中包括：1～5g/L的花宝1号，0.16～0.25mg/L的BA，0.16～0.25mg/L的NAA，1～2g/L的活性炭，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，pH值为5.5～6.5。优选的，所述离体保存的温度为23±2℃，光照强度为10～20μmol/(m2·s)，光照时间为10～14h/d。本专利技术提供了一种三色凤尾蕨组培方法，以孢子为外植体，通过孢子无菌萌发，绿色小球(GGB)诱导增殖、GGB分化、生根及离体保存等步骤，建立了三色凤尾蕨的组培快繁体系，两个月内增殖系数高达1：10以上，满足工厂化育苗的要求。本专利技术还提供了上述组培快繁方法在保存三色凤尾蕨种质资源中的应用，将利用组培快繁方法得到的GGB用于离体保存，继代周期达1.5年以上，可实现该珍稀物种的离体保存。具体实施方式本专利技术提供了一种三色凤尾蕨组培方法，以孢子为外植体，包括以下步骤：1)将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/L的NAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.5；2)将步骤1)所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；所述诱导增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.4mg/L的KT，0.6～1.5mg/L的2,4-D，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.5～6.5；3)将步骤2)所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗；所述分化生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括0.6～1.5mg/L的IBA，0.06～0.15mg/L的IAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，pH值为5.5～6.5。本专利技术所述三色凤尾蕨组培快繁方法，以孢子为外植体，将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/L的NAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.5。本专利技术在所述接种前，优选还包括将孢子置于无菌水中浸泡4～8h后消毒。本专利技术所述浸泡的时间优选为5～7h，更优选为6h。本专利技术所述消毒优选包括第一消毒和第二消毒，所述第一消毒优选为将浸泡后的孢子用体积分数为75％的乙醇溶液消毒5～7s，用无菌水冲洗2～5遍；所述第二消毒优选为用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液消毒5～10min，用无菌水水洗3～8遍。本专利技术对所述孢子的来源没有特殊限定，优选来源于成年三色凤尾蕨植株有成熟孢子的叶片，在本专利技术实施例中，所述孢子的获得方法，包括：在野外选择生长发育良好、没有病虫害的成年三色凤尾蕨植株，剪下长有成熟孢子的叶片，用普通信封装好带回实验室，通过自然脱落并挑选获得不含杂质的孢子。本专利技术所述第一消毒中，所述无菌水冲洗的次数优选为3遍。本专利技术所述第二消毒中，所述无菌水冲洗的次数优选为4～6遍，更优选为5遍。本专利技术所述萌发培养基包括萌发培养基S1和萌发培养基S2，所述萌发培养基S1中不包含NAA；所述萌发培养基S2中包括NAA，所述NAA在所述萌发培养基S2中的浓度为0.5mg/L。在本专利技术中，接种后约15天，在萌发培养基S1中最先观察到孢子萌发，约在50天左右萌发培养基S2中最早出现孢子体小苗。本专利技术优选将得到的萌发的孢子接种于萌发培养基S2进行继代1～2次，获得健壮的小苗备用。本专利技术对所述NAA的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可，细胞生长素NAA可促进孢子体发育长大。本专利技术所述萌发培养基包括蔗糖，所述蔗糖在所述萌发培养基中的浓度优选为16～24g/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三色凤尾蕨的组培方法，以孢子为外植体，其特征在于，包括以下步骤：1)将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/L的NAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.5；2)将步骤1)所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；所述诱导增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.4mg/L的KT，0.6～1.5mg/L的2,4‑D，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.5～6.5；3)将步骤2)所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗；所述分化生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括0.6～1.5mg/L的IBA，0.06～0.15mg/L的IAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，pH值为5.5～6.5。

【技术特征摘要】
1.一种三色凤尾蕨的组培方法，以孢子为外植体，其特征在于，包括以下步骤：1)将所述外植体接种于萌发培养基进行萌发培养，得萌发苗；所述萌发培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：0～0.5mg/L的NAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.5～6.5；2)将步骤1)所述萌发苗接种于诱导增殖培养基进行诱导增殖培养，得绿色小球；所述诱导增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.4mg/L的KT，0.6～1.5mg/L的2,4-D，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，所述诱导增殖培养基的pH值为5.5～6.5；3)将步骤2)所述绿色小球接种于分化生根培养基进行分化生根培养，得生根组培苗；所述分化生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括0.6～1.5mg/L的IBA，0.06～0.15mg/L的IAA，15～25g/L的蔗糖和5～6.2g/L的琼脂，pH值为5.5～6.5。2.根据权利要求1所述组培方法，其特征在于，步骤1)所述接种前，还包括将孢子置于无菌水中浸泡4～8h后消毒。3.根据权利要求2所述组培方法，其特征在于，所述消毒包括：将浸泡后的孢子用体积分数为75％的乙醇溶液消毒5～7s，用无菌水冲洗2～5遍，用质量浓度为0.1％的HgCl2溶液消毒5～10min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何俊，孟静，李村富，魏奇，杨俊波，李德铢，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53